雙孢蘑菇叢生變異分子機理的初步研究

王澤生 陳美元 廖劍華 盧政輝 郭仲杰 李洪榮

(福建省輕工業(yè)研究所, 福州, 350005)

摘要：以雙孢蘑菇正常菌株及其叢生變異菌株基因組DNA為模板，通過大規(guī)模的RAPD擴增，找到一個隨機引物U18，能區(qū)分正常及叢生菌株。將叢生菌株特異片段制成探針，Southern雜交表明該片段在雙孢蘑菇基因組中為單拷貝序列。純化該片段并克隆到pUC-T質(zhì)粒中，序列測定表明該片段長735bp，GenBank查詢結果表明該片段編碼了二氫硫辛酰胺脫氫酶(DLDH)C末端173個氨基酸。

關鍵詞：雙孢蘑菇 叢生變異 分子機理 RAPD DLDH

雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)是世界上栽培最多的一類食用菌。在人工栽培中，其子實體正常的生長形態(tài)為單生，菇形圓整。叢生即幾個子實體聚集而生，菌柄相連結，是雙孢蘑菇的一種異常生長形態(tài)。叢生變異的菌株表現(xiàn)為大部分子實體叢生，菌蓋因相互擠壓而變形，產(chǎn)生大量的畸形菇，降低了其商品價值。叢生在國內(nèi)的蘑菇栽培中較為少見，而在國外的機械化栽培中較常見，其原因尚未明了，但前期研究表明引起叢生的原因是菌株自身的變異而非栽培條件。由于叢生變異只表現(xiàn)于子實體，在菌種階段并無異常，故難以早期預測。國外的蘑菇菌種公司及栽培農(nóng)場每年因叢生造成的經(jīng)濟損失曾高達數(shù)百萬美元。目前世界上有好幾個實驗室從基因組DNA、RNA、mtDNA等不同角度探索雙孢蘑菇叢生變異發(fā)生的內(nèi)在因素。我們從基因組DNA的RAPD著手，對該變異的分子機理作了初步研究。

1 材料與方法

1.1 菌株: 雙孢蘑菇正常菌株AA,GG及其叢生菌株(由發(fā)生叢生變異的子實體中組織分離獲得) A34,A35,A41,G26/1/2由美國Sylvan公司提供，現(xiàn)保存于福建省蘑菇菌種研究推廣站。

1.2 試劑: Dig標記與檢測試劑盒、尼龍膜購自寶靈曼公司, 其余試劑購自上海生工公司。

1.3 方法：

1.3.1 基因組DNA提取、PCR、RAPD分析按以前的方法[1]。

1.3.2 探針制備: 以Dig-dUTP代替dTTP, 用PCR方法制備標記探針。

1.3.3 Southern雜交: 電泳膠經(jīng)EB染色照相后, 進行脫腺嘌呤及變性處理[2], 再通過真空轉(zhuǎn)移將DNA轉(zhuǎn)至尼龍膜上。使用Dig標記與檢測試劑盒, 按照廠家提供的方法進行非放射性Southern雜交及顯色。

1.3.4 目標條帶的純化與克隆[3]：用低熔點瓊脂糖法對目標條帶進行純化后連接到載體 pUC-T質(zhì)粒中, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109, 通過藍/白法篩選克隆子, 并用雙酶切和PCR方法進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 RAPD分析:

以雙孢蘑菇健康菌株AA、GG及其對應的叢生變異菌株A35、A41、G26/1/2等的菌絲體基因組DNA為模板, 使用75個隨機引物進行RAPD擴增, 發(fā)現(xiàn)有4個引物在不同程度上表現(xiàn)出健康與叢生菌株的差異，其中引物U18能很好地區(qū)分正常與叢生菌株。從圖1中可以看出, 在接近800bp處, 正常菌株只有一條帶，而叢生變異菌株除了產(chǎn)生該條帶外，還多出一條約750bp條帶。

M 1 2 3 4 5

　　 圖1 隨機引物U18對雙孢蘑菇正常及叢生菌株的

RAPD擴增圖譜

　　 Fig.1 RAPD pattern of healthy and clustered strains of

Agaricus bisporus amplified by the random primer U18

　　 M道: λDNA/EcoRI+HindⅢ Marker; 1-5道:菌株

AA, A35, A41,GG, G26/1/2總DNA的RAPD帶型。

←800bp Lane M: λDNA/EcoRI+HindⅢ Marker; Lane 1-5:

RAPD band patterns of the total DNA of AA,A35,A41, GG,

G26/1/2.

2.2 探針制備及Southern雜交

以消毒牙簽刺取凝膠中A41的差異帶作為模板，用U18引物通過PCR方法制備差異片段的Dig標記探針，標記的探針初步定量為20～30ng/ul。用該探針對A41、AA總DNA的 EcoRI或BamHI酶解產(chǎn)物進行Southern雜交，均只產(chǎn)生一條信號較強的雜交帶。該結果表明該片段在雙孢蘑菇基因組中為單拷貝序列(圖2), 說明它可能是某個特殊的基因片段，這給我們提供了進一步研究的可能。

1 2 3 4 5 6

圖2 用叢生特異探針對雙孢蘑菇基因組DNA的Southern雜交圖譜

Fig.2 Southern blotting pattern of genomic DNA of A.bisporus with cluster-special probe

1-6道: A41總DNA/EcoRI; AA總 DNA/EcoRI; A41總DNA/BamHI; AA總DNA/ BamHI; AA總DNA; 陽性對照.

Lane 1-6: A41 total DNA/EcoRI; AA total DNA/EcoRI; A41 total DNA/BamHI; AA total DNA/ BamHI; AA total DNA; Positive Control.

2.3 叢生差異帶的純化與克隆

叢生菌株A41　750bp處的RAPD差異條帶用低熔點瓊脂糖法加以純化，經(jīng)電泳驗證后克隆到PCR產(chǎn)物克隆專用載體pUC-T質(zhì)粒中。用藍/白法從三個培養(yǎng)皿中共篩選到45個白色克隆子, 經(jīng)酚/氯仿快速裂解并電泳鑒定后獲得兩個預期大小的克隆子, 編號為No.2和No.14。進一步用U18引物對這兩個克隆子進行PCR擴增, 發(fā)現(xiàn)No.14克隆子擴增出750bp條帶。用EcoRI和HindIII進行雙酶切分析, 結果顯示No.14克隆子切出了750bp條帶（因其帶部分載體序列，實際長度約800bp）。以上結果表明No.14克隆子已成功克隆到了顯示叢生差異的目標條帶（圖3）。

1 2 3 4 5 6 M

圖3 克隆子的PCR(引物U18)及雙酶切(EcoRI+

BamHI)鑒定

Fig.3 Determination of the recombinants by PCR

(with the primer U18) and double-enzyme (EcoRI+

BamHI) digestion

1-3道: 質(zhì)粒pUC-T,克隆子No.14和No.2的PCR

←800bp 帶型; 4-6道: 質(zhì)粒pUC-T,克隆子No.14和No.2的雙

酶切帶型; M道: 100bp DNA ladder

Lane 1-3: PCR band patterns of plasmid pUC-T,

recombinant No.14 and No.2; Lane 4-6: Double-

enzyme digestion patterns of pUC-T, recombinant No.14

and No.2; Lane M: 100bp DNA ladder

2.4 克隆條帶的序列測定及分析

根據(jù)pUC-T載體上的測序位點, 用M13正反向引物對克隆條帶進行序列測定。測序結果表明該片段長735bp(含兩端隨機引物)。把該序列轉(zhuǎn)為其mRNA序列, 通過Genbank查詢發(fā)現(xiàn), 從mRNA的5’端開始, 該序列編碼了一個部分開放讀框(ORF), 即二氫硫辛酰胺脫氫酶(DLDH) C末端的173個氨基酸。編碼序列有2或3個移碼：一個大約在210～215位置，一個在400～460之間（與其它真菌序列相比，雙孢蘑菇在此處有一20個氨基酸的非線性整合），可能還有一個在大約35位置。該ORF中剩余的下游215個堿基在Genbank中未找到明顯的同源序列。

3 討論

3.1 通過大量的RAPD實驗, 我們篩選到了U18引物, 能較好地區(qū)分雙孢蘑菇正常菌株及其叢生變異菌株, 為雙孢蘑菇叢生變異在菌種階段的早期預測提供了一種DNA水平的標記。但由于RAPD標記不夠穩(wěn)定, 要將其應用于生產(chǎn)，還需獲得更多的叢生變異菌株進行試驗, 以驗證該標記與叢生變異的相關性。

3.2 克隆序列編碼了DLDH　C末端的173個氨基酸, 該脫氫酶是線粒體基質(zhì)中的一種核編碼蛋白, 在細胞呼吸中起著重要作用, 不少重大的遺傳疾病都與該酶的遺傳缺陷有關。本研究結果表明了一種可能性, 即叢生變異可能與呼吸途徑有關，但這需要大量的實驗來論證。

3.3 在下一步的研究工作中，我們將研究在正常與叢生菌株中DLDH基因表達產(chǎn)物的差異，即DLDH酶蛋白活力的差異和mRNA的差異。如有必要，將構建兩類菌株的基因組文庫或cDNA文庫，爭取獲得兩類菌株完整的DLDH基因序列，通過構建限制性酶譜或序列分析等手段，確證該基因與叢生變異的相關性，最終闡明雙孢蘑菇叢生變異的分子機理。

參 考 文 獻

1 陳美元,廖劍華,王澤生. 雙孢蘑菇三種類型菌株的RAPD擴增研究. 食用菌學報, 1998, 5(4):6-10.

2 路建平主編, 非放射性雜交技術. ?？?南海出版公司, 1996:31-40.

3 J薩姆布魯克,E F弗里奇,T曼尼阿蒂斯著(金冬雁等譯). 分子克隆實驗指南(第二版). 北京:科學出版社, 1995:672-683.

A Preliminary Study on the Molecular Mechanism

of Clustering Variation of Agarucus bisporus

Zesheng Wang Meiyuan Chen Jianhua Liao Zhenghui Lu Zhongjie Guo　Hongrong Li

(Fujian Research Institute of Light Industry, Fuzhou, 350005)

Abstract: Using the genomic DNA of healthy strains and their clustering variation ones of A.bisporus as templates, a large scale of RAPD amplification was performed, and a random primer U18 was found to be able to distinguish the healthy and clustered strains. The probe was prepared with the cluster-special fragment. The result of Southern blotting suggested the fragment to be a single copy sequence in the genome of A.bisporus. The DNA fragment was purified and cloned into pUC-T plasmid. Sequencing result showed that the fragment has a size of 735bp, and encodes the C-terminal 173 amino acids of dihydrolipoamide dehydrogenase (DLDH).

Key Words: Agarucus bisporus, Clustering variation, Molecular mechanism, RAPD, DLDH