雙孢蘑菇的遺傳和育種

A.S.M.Sonnenberg，荷蘭霍爾斯特蘑菇試驗(yàn)站

陳美元譯自《Mushroom Science》15(1): 25-39, 荷蘭, 2000.5,王澤生校。

摘要：在過(guò)去幾十年里選育雙孢蘑菇的成果甚為匱乏。自從1980年育出第一個(gè)雜交種以后便沒(méi)有真正的新菌株問(wèn)世。然而，人們已經(jīng)在生活史、遺傳變異來(lái)源的可利用性以及育種的有效工具方面獲得了許多進(jìn)展，這些都是產(chǎn)生新菌株的前提。本文回顧了這些前提條件的發(fā)展情況，著重論述新的進(jìn)展。

1 前言

直到最近幾十年雙孢蘑菇的生活史才被完全揭開，顯示出在育種上的潛在價(jià)值。但從那以后，關(guān)于育種程序的報(bào)道卻很少出現(xiàn)。從通過(guò)育種獲得第一個(gè)雜交菌株并推向市場(chǎng)以后至今，二十年已經(jīng)過(guò)去了?，F(xiàn)在，多數(shù)菌株要么與第一個(gè)雜交種相同，要么非常接近。（譯者注：此結(jié)論有失偏頗，比如我國(guó)于89年育成的雜交新菌株AS2796經(jīng)美國(guó)Sylvan蘑菇公司鑒定，認(rèn)為在遺傳、栽培特性與質(zhì)量性狀等方面與U1系列都有顯著的差異。）雖然新的雜交種在產(chǎn)量的提高上有所貢獻(xiàn)，但世界性的生產(chǎn)發(fā)展卻是由于其它原因，即栽培面積的增加、栽培技術(shù)的完善、添加劑的使用和堆料的改進(jìn)。

有人將因此認(rèn)為回顧雙孢蘑菇的育種不是一個(gè)艱巨的任務(wù)。但這些印象在某種程度上是不真實(shí)的。雖然最近沒(méi)有真正的新菌株出現(xiàn)，但研究工作已取得相當(dāng)大的進(jìn)步，使得新菌株看來(lái)象是很快就會(huì)出現(xiàn)。因此，本篇主報(bào)告將重點(diǎn)論述與育種、育種技術(shù)及育種戰(zhàn)略有關(guān)的遺傳學(xué)新進(jìn)展。

選育新菌株的前提條件是：1）生活史的知識(shí)，2）作為變異來(lái)源的菌株的收集，3）有效的育種方法，包括評(píng)定感興趣性狀的可靠且快速的方法。新菌株缺乏的主要原因是過(guò)去這些條件都沒(méi)有得到充分滿足。尤其是雙孢蘑菇具有獨(dú)特的生活史，它妨礙了有效的育種并限制了菌株的遺傳多樣性，成為影響育種的主要障礙。我將盡量回顧有關(guān)論文的關(guān)鍵內(nèi)容并強(qiáng)調(diào)最新進(jìn)展。

2 雙孢蘑菇的生活史

雙孢蘑菇的生活史在過(guò)去已得到很好的研究（Raper et al.,1972;Elliott,1972）。菌株的親和性由一個(gè)交配型因子控制，可育性需要不同的等位基因?？捎臒o(wú)性菌絲體由一個(gè)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)組成，每個(gè)細(xì)胞含有不定數(shù)量的兩種不同遺傳型的核，具有相反的交配型（異核體）。在擔(dān)子，即菌褶上能產(chǎn)生孢子的特化細(xì)胞中，核的數(shù)量減為兩個(gè)，每種交配型各一個(gè)。核融合后進(jìn)行正常的減數(shù)分裂，大部分擔(dān)子產(chǎn)生兩個(gè)孢子，每個(gè)包含兩個(gè)非姐妹核(n+n)。出菇試驗(yàn)表明這些單孢培養(yǎng)物能夠產(chǎn)生子實(shí)體，即它們都含有兩種交配型。除了這種交配型基因的異等位現(xiàn)象，雙孢蘑菇看來(lái)通常還保留了其親本的異質(zhì)性(Royse & May,1982; Summerbell et al.,1989)。這可以這樣解釋：假定有一個(gè)機(jī)制偏愛(ài)非姐妹核的配對(duì)，那么減數(shù)分裂中就存在一個(gè)低重組率。前者由Evans(1959)的顯微觀察所支持，鏡檢顯示減數(shù)分裂紡綞體形成的結(jié)果是孢子的80%結(jié)合了非姐妹核。多個(gè)報(bào)道也表明雙孢蘑菇存在一個(gè)反常的低重組率(Royse & May,1982; Summerbell et al., 1989; Kerrigan et al., 1993)。只有少數(shù)擔(dān)子產(chǎn)生3或4個(gè)孢子，這類孢子的大部分是單倍體(n)，不結(jié)菇或只產(chǎn)生有限數(shù)量的子實(shí)體。這類孢子的單孢培養(yǎng)物產(chǎn)生的無(wú)性菌絲體，每個(gè)細(xì)胞（同核體）也包含數(shù)量不定（遺傳相同）的核。這種次級(jí)同宗配合生活史在所有的商品菌株和來(lái)自Alberta、加利福尼亞海岸及法國(guó)的野生分離株中均有發(fā)現(xiàn)(Kerrigan,1996)。雙孢蘑菇的其它特性是，除了同核體和異核體中不定數(shù)目的核以外，異核體中還缺乏鎖狀聯(lián)合。獨(dú)特的生活史及同核體和異核體間缺乏差異成了育種的一個(gè)嚴(yán)重的障礙。

最近，加利福尼亞發(fā)現(xiàn)了一個(gè)四孢擔(dān)子占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的稀有類群(Callac et al.,1993)。多數(shù)單孢培養(yǎng)物同核且不育表明它們的生殖方式是異宗配合。該類群與商業(yè)及野生分離的雙孢菌株均可相互雜交。遺傳分析表明該四孢種和雙孢種間甚至存在著保守的遺傳連鎖，也就是說(shuō)，二者基因組標(biāo)記的位置和序列相類似(Callac et al.,1997)。由于生殖方式的差異，進(jìn)行了一次品種身份測(cè)試，即雙孢蘑菇與四孢蘑菇雜交（異宗配合）對(duì)雙孢蘑菇與雙孢蘑菇雜交（次級(jí)同宗配合）。四孢種產(chǎn)生同核子代表明其繁殖方式趨于遠(yuǎn)系繁殖。觀察到的結(jié)果支持了這一點(diǎn)，即四孢變種和雙孢/四孢雜交種減數(shù)分裂的重組率要高于雙孢蘑菇(Callac et al.,1997; 1998; Sonnenberg et al.,1996b)。Imbernon等人（1996）已把決定擔(dān)孢子數(shù)目的遺傳因子初步定位于染色體I上，最近研究結(jié)果表明該決定因子的四孢等位基因也存在于一個(gè)法國(guó)類群(Callac et al.,1998)。品種間雜交育種表明四孢表型是顯性的，具有多樣的滲透性(Imbernon et al.,1996)，因此能轉(zhuǎn)移到商品菌株上。這無(wú)疑將推動(dòng)育種的進(jìn)程。

所獲得的生活史及遺傳方式的知識(shí)表明育種前提條件之一已得到滿足，雙孢蘑菇的育種具備了很好的可能性。

3 新種質(zhì)

直到70年代后期，靠機(jī)率篩選仍然是改良菌株的主要手段。Royse 和May（1982）查明所搜集到的商品菌株的遺傳表型數(shù)目非常有限。雖然存在這個(gè)缺點(diǎn)，F(xiàn)ritsche還是把這些傳統(tǒng)栽培菌株應(yīng)用于有較大風(fēng)險(xiǎn)的育種計(jì)劃之中(Fritsche,1984)，最終育成第一批雜種（Horst U1和U3）而聞名世界。然而，使用同樣的傳統(tǒng)菌株作進(jìn)一步的育種努力卻沒(méi)有獲得任何新菌株(Fritsche, 未發(fā)表結(jié)果)。大部分當(dāng)今的雜交菌株要么與這兩個(gè)雜交種相同，要么非常相似(Loftus et al.,1988; Sonnenberg et al.,1999; 本文)。Royse 和May(1982)以及Kerrigan(1990)已查明，雙孢蘑菇栽培菌株和收集的培養(yǎng)物表現(xiàn)出較低的遺傳變異性，這些保存菌株的大部分可能來(lái)自不到20個(gè)的歐洲獨(dú)立菌株。育種對(duì)變異來(lái)源的需要及加利福尼亞非歐洲種質(zhì)的發(fā)現(xiàn)(Kerrigan & Ross,1989) 使促進(jìn)雙孢蘑菇新種質(zhì)發(fā)現(xiàn)、描述、保藏的蘑菇屬種質(zhì)工程（ARP）得以啟動(dòng)（Kerrigan,1996）。自從ARP菌株1995年放開以后，現(xiàn)在很多育種小組都在使用它們。ARP菌株中的遺傳變異與栽培或傳統(tǒng)菌株中的遺傳單一性具有很大的不同(Kerrigan,1995; Sonnenberg et al.,1999;本文)。這些菌株還展示了當(dāng)今雜交種中未發(fā)現(xiàn)的許多令人感興趣的特性。已有報(bào)道表明一些野外收集菌株對(duì)白色雙孢蘑菇栽培中已知的三種主要的病原菌（圖1）表現(xiàn)出低敏感性或抗性。例如Dragt等人（1995）描述了ARP中的兩個(gè)菌株對(duì)干泡病的病原菌菌生輪枝菌具有部分的抗性。這些菌株的低敏感性結(jié)合農(nóng)場(chǎng)嚴(yán)格的衛(wèi)生條件足以防止大規(guī)模干泡病的暴發(fā)。在栽培品種中導(dǎo)入部分抗性也能降低殺真菌劑特別是施保功和百菌清的使用。

圖1 蘑菇生產(chǎn)中的三種主要病害。A：干泡?。ㄕ婢纳喼?；B：法蘭西病毒?。p孢蘑菇病毒）；C：細(xì)菌性斑點(diǎn)病（托拉斯假單胞桿菌）

另一種能在蘑菇生產(chǎn)中造成相當(dāng)大損失的病害是托拉斯假單胞桿菌引起的細(xì)菌性斑點(diǎn)病(Raniey et al.,1992)。Olivier等人（1997）應(yīng)用一種標(biāo)準(zhǔn)方法評(píng)估雙孢蘑菇菌株對(duì)斑點(diǎn)病的抗性，并在法國(guó)野生類群中發(fā)現(xiàn)數(shù)量可觀的野生菌株對(duì)該病表現(xiàn)出低敏感性。

食用菌中唯一研究較多的病毒病是雙孢蘑菇病毒病或法蘭西病(Van Zaayen,1979)。該病毒的基因組已被分割并發(fā)現(xiàn)它由至少10段主要的dsRNA構(gòu)成（Harmsen et al.,1989）。ARP菌株中沒(méi)有顯示法蘭西病典型的dsRNA帶型。許多ARP菌株有新的帶型，表明存在新的病毒類型(Sonnenberg et al.,1995)。然而大部分ARP菌株似乎沒(méi)有dsRNA。當(dāng)用感染病毒的商品菌株同核體與沒(méi)有病毒的野生菌株的同核體雜交以轉(zhuǎn)移法蘭西病的病毒時(shí)，發(fā)現(xiàn)了令人感興趣的結(jié)果。許多雜交種保留了病毒的dsRNA，但有時(shí)沒(méi)有或幾乎沒(méi)有任何癥狀(Sonnenberg et al.,1995)。而更令人感興趣的是有的雜種不能通過(guò)這種途徑感染，重復(fù)的嘗試也無(wú)濟(jì)于事。這些結(jié)果表明一些ARP菌株可能對(duì)商品菌株病毒病具低敏感性和/或抗性。

發(fā)現(xiàn)商品菌株的許多栽培特性會(huì)發(fā)生變化(Sonnenberg et al.,1996b)。這些特性是走菌時(shí)間或通風(fēng)誘導(dǎo)后的菇蕾形成時(shí)間。蘑菇栽培的最適溫度也會(huì)變化。上述表明第二個(gè)前提條件即育種變異來(lái)源的可利用性也已得到滿足。

4 遺傳標(biāo)記的發(fā)展

在過(guò)去的20年里向前邁出的重要一步是遺傳標(biāo)記的發(fā)展和應(yīng)用。在探索雙孢蘑菇的遺傳構(gòu)成，了解它的遺傳方式，獲得更多對(duì)菌株起源及其相互關(guān)系的認(rèn)識(shí)等方面，這些標(biāo)記已變得非常重要。首先，這些標(biāo)記在任何育種工程中已成為不可或缺之物。標(biāo)記可以預(yù)測(cè)某些遺傳因子的遺傳方式，這些遺傳因子或與性狀相關(guān)，或與包圍它的區(qū)域緊密連鎖。這使得在許多情況下不必檢測(cè)某一性狀的遺傳，因此加快了育種的進(jìn)程。

第一個(gè)標(biāo)記被用來(lái)研究雙孢蘑菇的性別。它們是表型特征如結(jié)菇能力（可育與不育）、營(yíng)養(yǎng)缺陷、孢子梗顏色及“野生”形態(tài)(Miller & Kananen,1972; Raper et al.,1972;Miller et al., 1974; Elliott,1972)。雜交種中這些表型的表達(dá)及在單孢子代中的遺傳的研究無(wú)疑奠定了雙孢蘑菇性別區(qū)分的基礎(chǔ)，因此揭示了其育種的潛力。然而這些標(biāo)記只能在子實(shí)體中檢測(cè)。隨著基因產(chǎn)物（蛋白）或DNA序列本身作為遺傳標(biāo)記的引入，一個(gè)實(shí)用且非常強(qiáng)大的技術(shù)在育種中變得可行。這些標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是：（1）數(shù)目巨大；（2）表達(dá)和檢測(cè)與生活史分開，從而在無(wú)性菌絲中可以檢測(cè)；（3）共顯性，即在雜交中可以檢測(cè)雙個(gè)等位基因。Royse 和 May（1982）首次引入了這些標(biāo)記之一，即同工酶。同工酶是具有相同反應(yīng)特性而氨基酸組成稍有不同的一類蛋白。這些差異導(dǎo)致電泳遷移的不同，因此在聚丙稀酰胺凝膠上產(chǎn)生不同的帶型。Royse 和May證明了同工酶在菌株分型和選擇性育種中的用途(Royse & May,1982a,1982b)。作為DNA標(biāo)記的第一個(gè)技術(shù)是限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP, Botstein et al., 1980)。該技術(shù)使用限制性內(nèi)切酶，每種酶識(shí)別雙鏈DNA上的單一位點(diǎn)，并在這些位點(diǎn)上斷開雙鏈。產(chǎn)生的片段可按長(zhǎng)度在凝膠上分開并轉(zhuǎn)移到尼龍膜，然后用標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，這些探針是一些短的DNA片段，可與尼龍膜上的互補(bǔ)序列結(jié)合。獨(dú)特帶型顯示的限制性片段數(shù)目和大小的不同反映了DNA序列的差異。由于有許多不同的限制性酶和甚至更多的可能的探針，該技術(shù)產(chǎn)生的標(biāo)記的數(shù)量接近無(wú)限。Horgen和Anderson小組第一次在傘菌研究中引入該技術(shù)(Anderson et al., 1984; Castle et al.,1987;1988; Summerbell et al., 1989)。該技術(shù)用于分離同核體時(shí)，看來(lái)是個(gè)強(qiáng)大而可靠的工具(Kerrigan et al.,1992)，并被用來(lái)構(gòu)建雙孢蘑菇的遺傳圖譜(Derrigan et al.,1993; Sonnenberg et al.,1996a)。除了RFLP，人們還發(fā)明了一個(gè)甚至更有效的方法來(lái)檢測(cè)DNA序列的差異，即多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR, Mullis et al.,1986)。PCR是合成和擴(kuò)增DNA的一種體外方法，待擴(kuò)增的序列被短單鏈DNA序列限制在特定區(qū)域。該項(xiàng)技術(shù)非常靈敏而且迅速，原則上只需幾個(gè)DNA分子，通過(guò)循環(huán)反應(yīng)，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可擴(kuò)增出相當(dāng)?shù)臄?shù)量，通過(guò)染色可在凝膠上直接看到條帶。標(biāo)準(zhǔn)PCR的前提條件是要知道待擴(kuò)增片段的序列。等位基因間的差異如插入和缺失將產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的PCR片段。堿基替換造成等位基因位點(diǎn)的特異性，據(jù)此可設(shè)計(jì)出等位基因特異引物。這種PCR即通常所說(shuō)的SCAR（確定序列擴(kuò)增區(qū)域，Paran & Michelmore,1993）。即使不知道某一生物體的任何序列，PCR也可以用來(lái)產(chǎn)生遺傳標(biāo)記，即使用很短（10bp）的引物可進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增(隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA；Williams et al.,1991)。Khush等人（1992）表明這些類型的標(biāo)記可用于雙孢蘑菇菌株分型及分離分析。

5 標(biāo)記中的一個(gè)特殊種類――重復(fù)序列

遺傳分析中功能最強(qiáng)的標(biāo)記來(lái)自于重復(fù)序列。它們可以很短，也可以是整個(gè)基因；每個(gè)單倍體基因組中可以有幾個(gè)拷貝，也可以有成百上千個(gè)拷貝。使用重復(fù)序列作標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是單個(gè)探針可以監(jiān)控許多位點(diǎn)，因此在菌株作圖和指紋分析中它是一個(gè)強(qiáng)有力的工具。

所知的一類重復(fù)序列是微衛(wèi)星或稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSR）。微衛(wèi)星是銜接排列的1-5個(gè)核苷酸重復(fù)單元，單元的數(shù)目從2到數(shù)千不等。它們分布于包括真菌在內(nèi)的所有真核基因組中(Tautz & Renz,1984)。微衛(wèi)星中重復(fù)單元的數(shù)目是高度可變的，取決于復(fù)制滑動(dòng)、不平等互換或其它未知的機(jī)制(Levinson & Gutman,1987; Schlotterer & Tautz,1992; Strand et al., 1994)。微衛(wèi)星主要用于PCR反應(yīng)，可根據(jù)微衛(wèi)星序列使用引物，如果微衛(wèi)星的不同拷貝較為靠近，其間的DNA就可以被擴(kuò)增出來(lái)。另外也可以使用微衛(wèi)星兩側(cè)的引物，因?yàn)槲⑿l(wèi)星的長(zhǎng)度是可變的，當(dāng)不同菌株的DNA作為目標(biāo)時(shí)，微衛(wèi)星兩側(cè)的引物可產(chǎn)生大小不同的條帶。一個(gè)好的例子是最近發(fā)表的鷹嘴豆(Cicer arietinum L.)圖譜，標(biāo)示了120個(gè)所謂的序列標(biāo)志微衛(wèi)星位點(diǎn)（STMS）(Winter et al.,1999)。微衛(wèi)星已用于雙孢蘑菇基因組的研究（與M.Loftus和 J.Labarere的個(gè)人通信），但尚未發(fā)表任何使用情況的數(shù)據(jù)。

微衛(wèi)星的長(zhǎng)度變化最近由于完全不同的原因已成為一個(gè)熱門的研究課題。人類數(shù)目漸增的遺傳失調(diào)與轉(zhuǎn)錄或非轉(zhuǎn)錄序列三核苷酸重復(fù)單元的反常擴(kuò)增有關(guān)(Dijan,1998)。其在真菌中是否有類似的作用不得而知，但最近有報(bào)道在Podospora anserina中微衛(wèi)星長(zhǎng)度與一個(gè)報(bào)告基因的表達(dá)存在連鎖關(guān)系(Khahnobish et al.,1999)。

5.1 可移動(dòng)的遺傳因子

真核基因組中研究最透徹的重復(fù)序列中有些是轉(zhuǎn)座因子或稱轉(zhuǎn)座子。它們是可移動(dòng)的遺傳因子，靠與非同源區(qū)域的結(jié)合可以漫延到整個(gè)基因組。在真核基因組它們可以極高的拷貝數(shù)存在，在果蠅基因組中占到10%，而在某些植物基因組中超過(guò)50%(Freeling,1984)。最近在絲狀真菌中也發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)座子(Oliver,1992)。真核轉(zhuǎn)座子可根據(jù)它們的轉(zhuǎn)座方式細(xì)分為兩類。I類轉(zhuǎn)座子通過(guò)RNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)座并通常編碼許多基因，其中總有一個(gè)是反轉(zhuǎn)錄酶基因(Boeke & Corces,1989)。II類轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座時(shí)需要單個(gè)蛋白，比如轉(zhuǎn)座酶，它在供體和目標(biāo)DNA剪接過(guò)程的處理中起作用(Plasterk,1995)。盡管以非復(fù)制方式轉(zhuǎn)座，II 類轉(zhuǎn)座子也可以靠從已復(fù)制的DNA轉(zhuǎn)座到尚未復(fù)制的DNA或同源姐妹染色單體間的互換來(lái)增加數(shù)量(Plasterk, 1995)。兩種類型的轉(zhuǎn)座子已在真菌中發(fā)現(xiàn)（請(qǐng)看近期回顧：Daboussi & Capy,1997; Kempken & Kuck, 1998）。

近來(lái)在雙孢蘑菇中已發(fā)現(xiàn)其它真菌中描述過(guò)的轉(zhuǎn)座子的大多數(shù)類型。實(shí)際上，雙孢蘑菇是被描述過(guò)這些可移動(dòng)因子的第一個(gè)擔(dān)子菌(Daboussi & Capy, 1997; Sonnenberg et al., 1999)。

II類轉(zhuǎn)座子中的一個(gè)成員Abr1是雙孢蘑菇中所描述的第一個(gè)可轉(zhuǎn)座因子(Sonnenberg, 1999)，它是一個(gè)300bp的短重復(fù)序列，兩側(cè)由11bp的反向重復(fù)序列包圍。商品菌株中每個(gè)單倍體基因組約有15個(gè)拷貝。短序列和實(shí)質(zhì)編碼區(qū)長(zhǎng)度的缺乏表明Abr1本身并不編碼轉(zhuǎn)座酶，其活動(dòng)性依賴于定位在另一條染色體上具轉(zhuǎn)座活性的一種轉(zhuǎn)座酶，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有關(guān)這種轉(zhuǎn)座酶的任何證據(jù)。子代分析顯示Abr1拷貝有一個(gè)正常的分離，表明沒(méi)有發(fā)生有效的轉(zhuǎn)座。這使得該重復(fù)序列在育種和后面即將談?wù)摰木觊g的關(guān)系研究上成為非常有用的標(biāo)記。

我們最近還發(fā)現(xiàn)雙孢蘑菇基因組中I類回復(fù)轉(zhuǎn)座子的兩個(gè)成員。多數(shù)這種類型回復(fù)轉(zhuǎn)座子的典型特征是存在長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）和兩個(gè)開放讀框（ORF）。第一個(gè)ORF編碼的一個(gè)基因與逆轉(zhuǎn)錄病毒中編碼病毒粒子外殼的gag基因具有同源性。

第二個(gè)ORF與逆轉(zhuǎn)錄病毒的pol基因具有同源性。該開放讀框產(chǎn)生病毒基因組復(fù)制及移入宿主基因組所需的多種蛋白。這些I類回復(fù)轉(zhuǎn)座子本身也可根據(jù)序列相似性及開放讀框上的基因序列細(xì)分為兩組。第一組命名為Tyl/copia，第二組Ty3/gypsy，都是在這二組的第一個(gè)轉(zhuǎn)座子發(fā)現(xiàn)之后命名的。

圖2 雙孢蘑菇中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)回復(fù)轉(zhuǎn)座子的示意圖。圖中多蛋白基因似有缺失，加上嚴(yán)重的甲基化作用，表明該轉(zhuǎn)座子不是活動(dòng)的。

雙孢蘑菇發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)回復(fù)轉(zhuǎn)座子命名為Tab1（Transposon of A.bisporus），屬于Tyl/copia組。它與植物中首次發(fā)現(xiàn)的回復(fù)轉(zhuǎn)座子之一煙草Tnt轉(zhuǎn)座子有很高的相似性(Grandbastien et al.,1989)。其LTR的長(zhǎng)度為260bp，兩個(gè)開放讀框（圖2）被鑒定為編碼前面提到的gag 和pol基因。商品菌株中發(fā)現(xiàn)了Tab1的一個(gè)近乎完整的拷貝（4037bp），命名為Tab1-1。Tab1-1與同組其它的LTR回復(fù)轉(zhuǎn)座子的聯(lián)合比較表明編碼反轉(zhuǎn)錄酶的pol基因區(qū)域中有近600bp的缺失。用Tab1-1作探針在商品菌株中可見到多條帶，表明Tab1以多于一個(gè)拷貝的形式存在。我們分析了兩個(gè)包含Tab1序列的其它基因組克隆，兩個(gè)克隆中均發(fā)現(xiàn)被截短的代表部分pol基因的Tab1拷貝。這些Tab1拷貝的切斷看來(lái)是由于其它可轉(zhuǎn)座因子的插入。數(shù)據(jù)庫(kù)檢索揭示第二因子與來(lái)自口蘑屬Tricholoma nauseosum的一個(gè)未發(fā)表的可轉(zhuǎn)座因子及稻枯病真菌Magnaporte grisea基因組中發(fā)現(xiàn)的回復(fù)轉(zhuǎn)座子MAGGY高度相似(Farman et al., 1996)。雙孢蘑菇中發(fā)現(xiàn)的序列命名為Tab2，是依照它與Ty3/gypsy回復(fù)轉(zhuǎn)座子的一個(gè)成員MAGGY的相似性。在兩個(gè)基因組克隆分析中，Tab1被Tab2 3’端的插入打斷，該3’端包含部分pol基因（整合酶）和一個(gè)842bp的LTR。當(dāng)Tab2 序列被用作探針時(shí)，在包含商品菌株DNA的Southern印跡中可見到大量的條帶，表明該轉(zhuǎn)座子以高拷貝數(shù)存在。對(duì)其它幾個(gè)包含Tab2 序列基因組克隆的分析再次揭示只有Tab2 3’末端或LTR序列的存在。在白色雙孢蘑菇中Tab2 是否存在一個(gè)全長(zhǎng)的拷貝目前尚未得知。

以上所述表明雙孢蘑菇基因組包含多數(shù)真核基因組中發(fā)現(xiàn)的LTR回復(fù)轉(zhuǎn)座子的兩種類型，且至少所分析的拷貝是不完整的。在描述過(guò)這些因子的首批擔(dān)子菌中，雙孢蘑菇是其中之一。序列聯(lián)合比較顯示Tab1的不同拷貝間存在高同源性（>96%），多數(shù)序列差異（85%）是由于GC向AT的轉(zhuǎn)換。這表明在雙孢蘑菇中一個(gè)突變機(jī)制可能已激活，該機(jī)制類似于粗糙脈孢菌中首次描述的RIP（重復(fù)誘導(dǎo)的點(diǎn)突變）（Selker,1990）。RIP是探測(cè)并通過(guò)多個(gè)GC向AT的轉(zhuǎn)換有效改變基因組復(fù)制的一個(gè)機(jī)制。重復(fù)單元不同拷貝間因而發(fā)生的序列轉(zhuǎn)換阻止了可能存在的危險(xiǎn)的異常重組并同時(shí)滅活轉(zhuǎn)座子。不同Tab2拷貝相關(guān)區(qū)域間的序列聯(lián)合比較揭示了序列的高度保守性，但基于轉(zhuǎn)座的序列轉(zhuǎn)換更少報(bào)道?；蚪M中重復(fù)序列可被改變的另一個(gè)已知的機(jī)制是Ascobolus immersus中所描述的MIP（減數(shù)分裂前的甲基化誘導(dǎo)）(Goyon & Faugerton,1989)。該機(jī)制與已復(fù)制序列嚴(yán)重的胞嘧啶甲基化有關(guān)，是滅活轉(zhuǎn)座子的另一個(gè)途徑。檢測(cè)序列是否被甲基化的一個(gè)有效方法是利用對(duì)甲基化敏感性不同的一對(duì)限制性內(nèi)切酶。比如限制酶HpaII和MspI，均識(shí)別序列CCGG，而當(dāng)?shù)诙€(gè)胞嘧啶被甲基化時(shí)，HpaII不再消化該位點(diǎn)而MspI卻對(duì)甲基化不敏感。用Tab1-1作探針，通過(guò)Southern印跡檢測(cè)經(jīng)HpaII和MspI消化過(guò)的商品菌株DNA，可發(fā)現(xiàn)甲基化的清晰證據(jù)。從帶型上可看出很大的不同，經(jīng)HpaII消化的基因組DNA得到大分子量的帶而用MspI時(shí)得到的帶分子量較小。用Tab2作探針時(shí)得到相同的結(jié)果。類似RIP的突變及嚴(yán)重的甲基化均表明兩種類型的轉(zhuǎn)座子在已檢測(cè)的商品菌株基因組中都是不活動(dòng)的。然而，當(dāng)檢測(cè)來(lái)自同一菌株的不同批菌絲體時(shí)，發(fā)現(xiàn)Tab1的甲基化圖譜是高度可變的，這一點(diǎn)令人感興趣。甚至在同一菇床上隨機(jī)分布的不同子實(shí)體間也可見到帶型的差異。是什么引起可變的甲基化作用，是否對(duì)表型有影響還不得而知。

應(yīng)用根據(jù)Tab1的LTR區(qū)域設(shè)計(jì)的引物在一個(gè)野生菌株同核體中擴(kuò)增出一個(gè)4660bp的片段，部分序列分析顯示該拷貝在pol基因中沒(méi)有缺失發(fā)生。由于該拷貝比商品菌株中發(fā)現(xiàn)的Tab1-1拷貝長(zhǎng)，所以該回復(fù)轉(zhuǎn)座子可能是完整無(wú)缺的。Southern分析表明這個(gè)野生菌株的同核體中Tab1只有單個(gè)拷貝。當(dāng)用限制酶HpaII和MspI進(jìn)行消化時(shí)，發(fā)現(xiàn)帶型沒(méi)有差異，表明野生菌株中的單拷貝沒(méi)有被甲基化。這與其它報(bào)道中只有重復(fù)序列被甲基化的情況相符(Faugerton et al.,1990)。目前我們正在測(cè)試命名為Tab1-4的該Tab1拷貝是否可被轉(zhuǎn)錄，如果可以，則可能仍有活性。

最后的一個(gè)重復(fù)序列作為一個(gè)EcoRI消化的片段從蘑菇的基因組中被幸運(yùn)地克隆出來(lái)(Castle et al., 1987)。使用該片段作探針在雙孢蘑菇、大肥菇、A.subfloccosus和A.pattersonae中可見到中度重復(fù)序列(與Kerrigan的個(gè)人通信)。目前尚未確定該重復(fù)序列的明確界限，并且在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與任何序列具有同源性。最新的重復(fù)序列被命名為Abr3。

6 系統(tǒng)發(fā)育和重復(fù)序列；現(xiàn)代雜交種的起源

重復(fù)DNA和可轉(zhuǎn)座因子的遷移性被認(rèn)為是基因組可塑性的一個(gè)重要機(jī)制和物種變異性的一個(gè)來(lái)源(Dobinson & Hamer,1993; Daboussii & Capy,1997)。因此，以上提到的重復(fù)因子在更好地研究菌株起源和它們的相互關(guān)系上顯得非常有用就不足為怪了。用Abr1、Tab1和Abr3作探針，在8個(gè)傳統(tǒng)栽培菌株中只見到兩種不同的基因型（圖3）。這兩種基因型與1980年以前使用的傳統(tǒng)栽培種的表型（白色與乳白色）相一致(Fritsche & Sonnenberg,1988)。這意味著用不同名稱進(jìn)入市場(chǎng)的許多菌株在遺傳上非常相似。當(dāng)用同樣的探針檢測(cè)現(xiàn)在的雜交種時(shí)獲得了可比的結(jié)果。在測(cè)試的9個(gè)商品菌株中只發(fā)現(xiàn)一種基因型（圖4）。大多數(shù)商業(yè)雜交種的來(lái)源是保持完好的秘密。而Horst U1的構(gòu)建已被很好地證明(Fritsche,1983)。Horst U1是由白色菌株Somycel 53的培養(yǎng)物H39與乳白色菌株Somycel 9.2的培養(yǎng)物H97分離出的不育單孢雜交后獲得的。該雜交種上市后幾個(gè)月內(nèi)便出現(xiàn)了其它雜交種。在表型上與第一個(gè)雜交種并不能區(qū)分的這些“新”雜交種的上市時(shí)間暗示了它們要么是第一個(gè)雜種的復(fù)制品，要么是其可育單孢分離物。在后一種情況中，表型保持不變并不足為怪，因?yàn)殡p孢蘑菇典型的生活史趨向于在子代中保留親本的雜合性(Summerbell et al.,1989)。前期研究表明在白色和乳白色菌株中Abr1的多數(shù)拷貝在基因組中的定位是不同的(Sonnenberg et al.,1999)。Tab1基因組定位的檢測(cè)獲得了相似的結(jié)果（未發(fā)表）。這些差異最具爭(zhēng)論的解釋是轉(zhuǎn)座子已自主分布到每個(gè)菌株。換句話說(shuō)，如果兩個(gè)菌株有一個(gè)共同的祖先，則兩種類型栽培種分離后已發(fā)生了轉(zhuǎn)座。由于近期沒(méi)有跡象表明兩個(gè)轉(zhuǎn)座子發(fā)生了轉(zhuǎn)座，這些結(jié)果暗示了兩種類型的栽培種并不緊密相關(guān)。當(dāng)用Abr1、Tab1和Abr3作探針時(shí)，當(dāng)今的棕色菌株也顯示了一致的帶型。然而這些帶型與白色或乳白色菌株中所見的帶型差異很大（圖3）這意味著傳統(tǒng)栽培種至少可細(xì)分為在遺傳上不相關(guān)的三種類型。因此，原先認(rèn)為世界上所有的雙孢蘑菇傳統(tǒng)白色栽培種均來(lái)自1926年發(fā)生于奶油色蘑菇菇床上的那叢著名的“雪白”蘑菇(Lambert,1959; San Antonio,1984)的看法并不確切。

圖3 用重復(fù)因子作探針的傳統(tǒng)栽培種的指紋圖譜。A片：Abr3作探針的帶型。Lane 1:Le Lion B62; 2:Sinden A4; 3:Somycel 9.2; 4:Le Lion B14; 5:Les Miz 66; 6:Les Miz Y217; 7:Somycel 53; 8:Amycel 2400; 9:Amycel 456; 10:Le Lion C9; 11:Royal 101; 12:Marker。B片：Abr1作探針的帶型。 Lane 1:Le Lion B62; 2:Sinde A4; 3:Somycel 9.2; 4:Somycel 76; 5:Le Lion B14; 6:Les Miz 66; 7:Les Miz Y217; 8:Somycel 53; 9:Amycel 2400; 10:Amycel 456; 11:Le Lion C9; 12:Royal 101; 13:marker。三種類型栽培種表示為I：乳白色菌株，II：白色菌株，III：棕色菌株。

重復(fù)序列在野外收集菌株的基因分型中也非常有用。栽培種中見到的一致性和蘑菇屬種質(zhì)工程(Kerrigan,1996)菌株中見到的高度可變性形成了對(duì)比。然而，當(dāng)用Abr1和Tab1對(duì)野外收集物進(jìn)行篩選時(shí)也發(fā)現(xiàn)了一些驚人的相似性。采集自鄰近地點(diǎn)的許多菌株顯示出相同或相似的圖譜表明了這些菌株間的無(wú)性繁殖關(guān)系。也發(fā)現(xiàn)有的圖譜與三種傳統(tǒng)栽培種之一相同，這可能代表“逃脫”的菌株或已被馴化的原始野生菌株。雙孢和四孢品種中Abr1拷貝數(shù)目的顯著差異也支持Abr1在系統(tǒng)發(fā)育研究中的有用性(Sonnenberg et al.,1999)。

用轉(zhuǎn)座因子作探針篩選ARP收集物時(shí)，偶然見到有的菌株根本沒(méi)有雜交信號(hào)。從ARP收集菌株得到的有效數(shù)據(jù)表明這些菌株可能代表不同于雙孢蘑菇的另一個(gè)種。因此我們檢測(cè)了好幾個(gè)蘑菇種和其它一些代表性食用菌的種中是否存在這四個(gè)重復(fù)因子（表1）。這些分析顯示所有因子在非蘑菇種中均不存在，且Abr1和Tab2只存在于雙孢蘑菇中。因此，從野外收集菌株中鑒定出雙孢蘑菇種質(zhì)，這些重復(fù)因子是非常有用的。

圖4 用3個(gè)不同重復(fù)因子作探針的9個(gè)商品菌株的帶型。Lane 1:Amycel 2800; 2:Le Lion X8; 3:Somycel 608; 4:Horst U1; 5:Int.Spawn 643; 6:Sylvan 100; 7:marker; 8:Le Lion X22; 9:Le Lion X20; 10:Somycel 512。每個(gè)分析使用的探針標(biāo)示在下方。

表1 重復(fù)因子在不同食用菌種中的出現(xiàn)

物種 Abr1 Abr3 Tab1* 　Tab2

大肥菇 －　　　　＋　　　　±　　　?。?p> 野蘑菇　　　　　　　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> 赭鱗蘑菇　　　　　　　　　　－　　　?。　　　。　　　。?p> 球基蘑菇　　　　　　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> 蘑菇　　　　　　　　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> Agaricus excellens　　　　　　 －　　　?。　　　　馈　　　。?p> 巨孢蘑菇　　　　　　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> 楊樹菇　　　　　　　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> 側(cè)耳　　　　　　　　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> Stropharia rugoso annulata ?。　　　。　　　。　　　。?p> 毛頭鬼傘　　　　　　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> 紫丁香蘑　　　　　　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> 雙孢蘑菇（白色）　　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> 雙孢蘑菇（乳白色）　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> 雙孢蘑菇（棕色）　　　　　?。　　　。　　　。　　　。?p> *± 弱雜交信號(hào)

7 數(shù)值標(biāo)記和連鎖分析

標(biāo)記可以通過(guò)它們的親本類型在子代中的遺傳而確定其在基因組的位置。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)標(biāo)記被定位于同一條染色體上時(shí)，親本類型在超過(guò)50%的子代中被共同遺傳。當(dāng)定位于不同的染色體上時(shí)，發(fā)現(xiàn)親本與非親本類型的比例為1:1。對(duì)分離數(shù)據(jù)的解釋或曲解的難度可以有許多理由。其一是親本類型的不均衡分離可能是由于子代中不存在某種遺傳組合。另外，當(dāng)一對(duì)標(biāo)記位于染色體相對(duì)的末端，重組頻率將可能接近于50%，與位于不同染色體上的一對(duì)標(biāo)記類似。這些及其它模糊問(wèn)題可以通過(guò)在完整分離的染色體上設(shè)定引物而得以解決。多數(shù)真菌染色體大小范圍在1-10Mb之間并可以通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳完整地分開(Chu et al.,1986)。好幾個(gè)研究小組已解決了雙孢蘑菇的染色體問(wèn)題(Royer et al.,1992; Lodder et al.,1993; Sonnenberg et al.,1996)。Sonnenberg 等人（1996）已將組成Horst U1的兩個(gè)同核體分離為11條帶。多個(gè)DNA序列（探針）與包含完整染色體的膜雜交而應(yīng)用于染色體研究。這些數(shù)據(jù)結(jié)合分離分析明確表明每個(gè)同核體的11條帶代表13條染色體。

由于連鎖分析是高效育種工程的基礎(chǔ)，遺傳標(biāo)記的數(shù)值表示應(yīng)該是快速而可靠的。同工酶標(biāo)記和RFLP是非常強(qiáng)大的標(biāo)記，在沒(méi)有圖譜數(shù)據(jù)可用時(shí)，它們實(shí)際上成了選擇標(biāo)記(Spear et al.,1983; Kerrigan et al.,1993; Sonnenberg et al.,1996)。然而這些類型標(biāo)記的檢測(cè)是耗時(shí)的。當(dāng)用重復(fù)序列作探針時(shí)，可即時(shí)監(jiān)測(cè)許多位點(diǎn)的分離，雙孢蘑菇中已用到Abr1、Tab1和Abr3（將有進(jìn)一步的說(shuō)明）。以PCR為基礎(chǔ)的標(biāo)記分析更是快速得多，特別是不需要任何序列數(shù)據(jù)的RAPD分析。而基于已知序列的PCR分析如前面提到的SCARS，則更為可靠。

圖5 以兩個(gè)不同的重復(fù)序列為引物組合獲得的PCR片段的帶型。用“P”標(biāo)出的泳道代表親本類型，用“offspring”標(biāo)出的泳道顯示條帶的分離。凝膠右邊的數(shù)字表示染色體，通過(guò)分離分析各個(gè)條帶可指定到相應(yīng)的染色體上。

圖6 通過(guò)重復(fù)序列標(biāo)記（RFLP或PCR）的分離分析構(gòu)建的一個(gè)遺傳連鎖圖。以每條染色體上末端為起點(diǎn)的標(biāo)記位置標(biāo)在左側(cè)，標(biāo)記名稱標(biāo)在右側(cè)。

類似于由長(zhǎng)度變化和微衛(wèi)星基因組位置引起的基因組變異的檢測(cè)（見第5節(jié)），前面論述的雙孢蘑菇中類轉(zhuǎn)座子序列可用于相同的途徑。人們發(fā)展了一種基于PCR的方法檢測(cè)包含一個(gè)Abr1拷貝的位點(diǎn)。結(jié)果顯示了在兩個(gè)傳統(tǒng)栽培種中，該遺傳因子在基因組上的定位是不同的。一個(gè)栽培種類型的Abr1兩側(cè)的一對(duì)引物在另一栽培種類型中產(chǎn)生較短的片段，原因是后者中Abr1的缺失。設(shè)計(jì)了包含轉(zhuǎn)座子Tab1區(qū)域的類似引物。另外，還設(shè)計(jì)了轉(zhuǎn)座子序列引物并用不同組合擴(kuò)增相鄰轉(zhuǎn)座子之間的基因組區(qū)域。這看來(lái)已成為位點(diǎn)作圖的最有效的方法之一。圖5顯示用一個(gè)引物對(duì)（每個(gè)代表不同的重復(fù)序列）擴(kuò)增一個(gè)栽培菌株和一個(gè)野生菌株的同核體及它們的同核子代的帶型。用該特異引物對(duì)，可立即標(biāo)出6條染色體上的6個(gè)位點(diǎn)。結(jié)果清楚地體現(xiàn)了重復(fù)序列中作圖中的價(jià)值，圖6給出的遺傳圖證明了這一點(diǎn)（DRAWMAP軟件建圖，Stam,1993）。不管使用的是RFLP技術(shù)或PCR，該連鎖圖上的標(biāo)記幾乎全部來(lái)自重復(fù)序列。不同染色體上標(biāo)記密度的變化反應(yīng)了重復(fù)序列在雙孢蘑菇基因組內(nèi)的分布。不同重復(fù)序列與分離的完整染色體雜交結(jié)果顯示，特別是11號(hào)和12號(hào)染色體包括了Tab1和Abr3的許多拷貝，而9號(hào)染色體不包含任何已知的轉(zhuǎn)座子類似序列。該條染色體僅包含一個(gè)重復(fù)序列，體現(xiàn)于包含核糖體DNA基因的銜接排列的核糖體單元。因此，圖中所示9號(hào)染色體上的標(biāo)記可能代表一個(gè)特殊的PCR片段。

該圖還顯示了兩個(gè)與PCR標(biāo)記連鎖的重要表型，即位于1號(hào)染色體上的交配型和8號(hào)染色體上的菇蓋顏色。由于該圖中所用的子代來(lái)自一個(gè)商品菌株與野生菌株的雜交種，這些結(jié)果也表明了野生同核體有13條染色體。到目前為止我們研究過(guò)的其它野生同核體具有相同的染色體數(shù)目，包括四孢變種A.burnettii。這暗示著在雙孢蘑菇種內(nèi)13條的染色體數(shù)目是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。

8 與表型連鎖的標(biāo)記

遺傳標(biāo)記可以用來(lái)標(biāo)出由某一位點(diǎn)決定的、通常以“是/否”方式表達(dá)的性狀，也可標(biāo)出通常由更多基因決定的更為復(fù)雜的數(shù)量表達(dá)性狀(Lynch & Walsh,1998)。目前雙孢蘑菇中僅有有限數(shù)量的表型與遺傳標(biāo)記連鎖，所有這些表型看起來(lái)主要由單一位點(diǎn)決定。最初的一個(gè)是交配型(Xu et al.,1993; Sonnenberg et al.,1996)，它被定位在最大的染色體即1號(hào)染色體上。雙孢與四孢蘑菇雜交種子代的分離分析表明同一條染色體也包含了擔(dān)孢子數(shù)目（BSN）的主要決定因子(Imbernon et al., 1996)。兩個(gè)表型在育種工程中均扮演著突出的角色。與交配型連鎖的標(biāo)記在雙孢蘑菇對(duì)雙孢蘑菇次級(jí)同宗配合的同核體篩選中特別有用。包括交配型在內(nèi)的所有位點(diǎn)在同核體中主要是以同點(diǎn)等位基因存在的。然而異核體子代由于重組產(chǎn)生的多個(gè)位點(diǎn)也可以是同點(diǎn)等位基因。一般來(lái)說(shuō)，篩選生長(zhǎng)緩慢的單孢分離物（SSI）可得到高比率的同核體(Fritsche,1984)。而在單孢分離物中預(yù)篩選生長(zhǎng)緩慢者，再用交配型連鎖的標(biāo)記進(jìn)一步篩選同點(diǎn)等位基因，則獲得的幾乎所有的單孢分離物均是同核的(Kerrigan et al.,1992; Sonnenberg, 未發(fā)表)。同樣的標(biāo)記在選擇用于回交或與其它菌株交配的合適的交配型等位基因方面也是有用的。與擔(dān)孢子數(shù)目連鎖的標(biāo)記可用于向商品菌株引入遠(yuǎn)系的性狀。四孢擔(dān)子的出現(xiàn)將加快同核單孢分離物的分離。發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)重要表型的遺傳標(biāo)記是菇蓋顏色或稱pilei-pellis顏色(Loftus et al.,1995及本論文集,Callac et al.,1998; Sonnenberg,本文)。

要發(fā)現(xiàn)其它重要性狀如產(chǎn)量、質(zhì)量及抗病性的標(biāo)記將更加困難。這些性狀通常是數(shù)量遺傳并且象是由多基因決定。另外，由于同時(shí)產(chǎn)生的遺傳和環(huán)境的影響，對(duì)這些性狀的評(píng)估是困難的。在雙孢蘑菇野生菌株中已發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌性斑點(diǎn)病(Olivier et al.,1997)和干泡病(Dragt et al.,1995)的抗性或低敏感性。在評(píng)估托拉斯假單胞桿菌(Olivier et al.,1997)和真菌寄生輪枝菌(Mamoun & Olivier, 1995)的感染方面已取得一些進(jìn)展，但仍缺乏滿意的數(shù)量表示方法?？芍貜?fù)的量化方法是發(fā)現(xiàn)與這些性狀連鎖的遺傳標(biāo)記的前提。

在一批來(lái)自栽培種與野生種的雜交菌株的子代中，我們測(cè)量了第一個(gè)菇蕾形成的時(shí)間以及兩個(gè)菇潮的平均菇柄長(zhǎng)度。應(yīng)用MapQTLTM軟件(Van Ooijen & Malienaard,1996)發(fā)現(xiàn)了與這些性狀（LOD3.0）顯著連鎖的染色體區(qū)域，表明原則上可以發(fā)現(xiàn)數(shù)量性狀的標(biāo)記。

繼核DNA編碼的性狀作圖之后，重點(diǎn)要指向作為基因組變異的一個(gè)來(lái)源的線粒體基因組。De la Bastide等人（1997）為線粒體DNA序列和核-線粒體相互作用對(duì)雙孢蘑菇生長(zhǎng)的影響提供了證據(jù)。把線粒體基因組包括到育種工程中應(yīng)該不難，因?yàn)殡p孢蘑菇野生種群的線粒體DNA中存在廣泛的變異(Xu et al.,1998)，并且雜交和去異核化會(huì)產(chǎn)生許多核-線粒體組合體(Khush et al.,1995; Sonnenberg et al.,1995)。

9 遺傳轉(zhuǎn)化

繼經(jīng)典育種之后，選擇性標(biāo)記的改進(jìn)，使得一項(xiàng)新技術(shù)在育種中已變得實(shí)用，即遺傳轉(zhuǎn)化。該技術(shù)通過(guò)引入其它菌株或其它物種的DNA序列、基因組整合并表達(dá)使菌株的遺傳改變。該技術(shù)已在植物、動(dòng)物和真菌的育種中完全實(shí)現(xiàn)，但直到現(xiàn)在，該技術(shù)在雙孢蘑菇中仍不實(shí)用。關(guān)于雙孢蘑菇遺傳轉(zhuǎn)化的第一個(gè)報(bào)告可追溯到1996年(Van de Rhee et al.,1996)。在這兒潮霉素抗性被引入作為轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇標(biāo)記。結(jié)合在一個(gè)廣泛使用的質(zhì)粒上的標(biāo)記用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)入原生質(zhì)體。然而其它實(shí)驗(yàn)室到目前為止仍無(wú)法重復(fù)該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(Van de Lende & Wessels, Challen, Mikosch,個(gè)人通信)。最近，原先為植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化設(shè)計(jì)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)被應(yīng)用到雙孢蘑菇和許多其它真菌的轉(zhuǎn)化中(De Groot et al.,1998)。該系統(tǒng)在其它實(shí)驗(yàn)室看來(lái)也可轉(zhuǎn)化。Mikosch等人（本論文集）已能進(jìn)一步優(yōu)化該技術(shù)，使之成為轉(zhuǎn)化雙孢蘑菇無(wú)性菌絲體的有效方法，從而使商品菌株的遺傳改變具有可能性。

遺傳工程食品在消費(fèi)者中暫時(shí)并不流行。但系統(tǒng)本身是基因功能研究的一個(gè)不可缺少的工具。它允許序列在基因組中有目的的整合，也因此可造成被選擇基因的中斷。對(duì)已知表型的繼后研究可闡明各自基因的功能。該基因工程工具也為工業(yè)或醫(yī)藥用途的非食品成份的生產(chǎn)菌株的構(gòu)建提供了前景。額外的作用是能擴(kuò)大食用菌產(chǎn)品市場(chǎng)，因?yàn)橄M(fèi)者對(duì)遺傳改變?cè)诜鞘称纺康纳系膽?yīng)用一般反應(yīng)較為平淡。

10 總結(jié)性評(píng)論

以上提供的信息表明雙孢蘑菇新菌株開發(fā)的前提條件均已得到滿足。生活史已知且允許育種。多樣化的野生收集菌株是有用的，其中已發(fā)現(xiàn)許多令人感興趣的特性。最后，育種新技術(shù)的開發(fā)已取得重要進(jìn)展，特別是遺傳標(biāo)記的發(fā)展與檢測(cè)。食用菌業(yè)中的許多人常常提出這樣的問(wèn)題：新菌株何時(shí)問(wèn)世？為什么要花這么長(zhǎng)時(shí)間？我希望本篇綜述已講清楚這一點(diǎn)，即直到最近，產(chǎn)生新菌株的所有前提條件才得到滿足。Fritsche推出第一個(gè)雜交種時(shí)邁出的重要一步是不容易重復(fù)的。她用傳統(tǒng)栽培種制造新菌株(Fritsche,1986)，這些栽培種得到了許多在育種過(guò)程中被明顯保留下來(lái)的優(yōu)良性狀。然而，許多有意義的性狀栽培種中不存在，卻在毫無(wú)商業(yè)價(jià)值的野外收集菌株中發(fā)現(xiàn)。雖然標(biāo)記技術(shù)顯著加快育種的進(jìn)程，但要把一個(gè)特殊性狀轉(zhuǎn)移到當(dāng)今商品栽培種中也是一項(xiàng)耗時(shí)的工作。一般觀點(diǎn)認(rèn)為我們現(xiàn)在離新菌株的誕生為期不遠(yuǎn)了。作這種聲明需要一定的慎重，因?yàn)榻?jīng)驗(yàn)表明,“不久將出現(xiàn)”的承諾與市場(chǎng)上實(shí)際出現(xiàn)之間可能還有一段時(shí)間(Loftus et al.,1995)。

11 致謝

本工作由Bromyc和海牙園藝產(chǎn)品局提供部分支持。我想特別感謝Jose in ‘t Zandt-Linders和Karen den Hollander女士的技術(shù)幫助及L.J.L.D.van Griensven和J.J.P.Baars的有幫助的評(píng)論性意見。

參考文獻(xiàn)（略）