第二節(jié)　消毒與滅菌

一、消毒與滅菌的概念

在延期界中，微生物無處不有，無孔不入，如制種所用的原料、水、工具、設備、操作的雙手和衣著以及空間，都有大量的微生物存在。因此要分離和培養(yǎng)食用菌純種，首先必須將培養(yǎng)基進行滅菌達到滅菌狀態(tài)，并對生產過程的各個環(huán)節(jié)以及環(huán)境也必須進行消毒，晝減少其它微生物的存活而造成生產的污染，因此消毒滅菌是菌種生產過程中必須掌握的最主要關鍵技術之一。

（一）消毒　具有殺死致病微生物的作用或方法，稱為消毒。就食用菌菌種生產而言，消毒是指用物理或化學方法殺滅或消除對食用菌生長發(fā)育有害的微生物，通常只能消滅物體表面或環(huán)境中的一部分微生物，有能達到消滅所有微生物。

（二）滅菌　指徹底殺菌，即用物理或化學等方法，殺死物體上的一切微生物，以及它們的芽胞和孢子，使物體成為無菌狀態(tài)。

二、常用消毒和滅菌方法

（一）物理滅菌方法　通過高潮、射線、微波以及器械進行滅菌或除菌的方法均為物理滅菌方法。

１、熱力滅菌　利用高潮殺死微生物的方法，稱為熱力滅菌。微生物組成的最重要成份是蛋白質、核酸等，當高潮時會引起蛋白質和核酸不可逆的變性或凝固，使細胞失去了生理機能，停止生長發(fā)育，直至生化瓜停止而終止生命。此外高溫尚可破壞細胞的　其他組成，或者使細胞的脂肪膜受熱溶解而形成了極大的孔，導致細胞內含物泄漏而引起死亡，從而達到高潮滅菌的效果。

熱力滅菌經常使用兩個殺菌指數：熱死溫度和熱死速度。前者指在１０分鐘內可以殺死細菌懸液中所有細胞的溫度，后者指在一定溫度下，殺死所有細胞所需的時間。在同樣溫度條件下，熱死溫度高的微生物，其熱死速度慢，熱死溫度低的微生物，其熱死速度快。提高滅菌溫度，可以加快熱死速度。因此，可以通過提高滅菌溫度來縮短滅菌時間，或延長滅菌時間以降低滅菌溫度。

熱力滅菌經濟有效，簡便易行，是最普遍采用的方法，它可以分為濕熱滅菌和干熱滅菌兩種。

（１）濕熱滅菌　指利用熱蒸汽殺死微生物。由于蒸汽的穿透力較熱空氣強，蛋白質、原生質膠體在濕熱條件下容易變性凝固，酶系統容易被破壞，蒸汽進入細胞內凝結成水，能放出潛在熱量而提高溫度，更增強了殺菌力。常用濕熱滅菌方法圾如下幾種。

A.高壓蒸汽滅菌法

利用高溫高壓蒸汽進行滅菌的方法。高壓蒸汽滅菌可以殺死一切微生物，包括細菌的芽孢，真菌的孢子或休眠體等耐高溫的個體。滅菌的蒸汽溫度隨蒸汽壓力增加而升高，增加蒸汽壓力，滅菌的時間可以大大縮短。因此它是一種最有效的、使用最廣泛的滅菌方法。蒸汽壓力與蒸汽溫度的關系見下表。

高壓滅菌所采用的蒸汽壓力與滅菌時間，應根據具體滅菌物質而定。液體培養(yǎng)基滅菌時，一般采用1.0Kg/cm2,溫度121.30℃,滅菌30分鐘;母種、栽培種等固體培養(yǎng)基滅菌時，通常采用1.5Kg/cm2,溫度129℃,滅菌1-2.5小時。

但有些固體培養(yǎng)基導熱性差，培養(yǎng)基中耐熱性微生物又較多，如制備蘑菇栽培種的河泥烘料培養(yǎng)基，滅菌時間或滅菌壓力要有所增加，通常壓力為2Kg/cm2,滅菌時間為4小時。

使用高壓蒸汽滅菌時，應注意以下幾點：

ａ、滅菌鍋內的冷氣必須排盡。冷空氣的熱膨脹系數大，若無菌鍋內留有冷空氣，當滅菌鍋密閉加熱時，冷空氣受熱很快膨脹，使壓力上升，造成滅菌鍋內壓力與溫度不一致，產生假性蒸汽壓，鍋內溫度低于蒸汽壓表示的相應的溫度，致使滅菌有能徹底。特別是使用只裝有壓力表，沒有溫度表的滅菌鍋時，尤應注意。

排除冷空氣的方法有兩種：緩慢排氣和集中排氣。緩慢排氣法，即開始加熱滅菌時便打開排氣閥門，隨滅菌鍋內溫度逐漸上升，鍋內的冷空氣便逐漸排出，當鍋內溫度上升到100℃,大量蒸汽從排氣閥中排出時，即可關閉排氣閥，進行升壓滅菌。集中排氣法，即在開始加熱滅菌時，先關閉排氣閥，當壓力升到0.5Kg/cm2左右時，打開排氣閥，集中排出空氣，讓壓力降到零，并有大量蒸汽排出時，再關閉排氣閥進行升壓滅菌。固體培養(yǎng)基滅菌時可采用集中排氣法。液體培養(yǎng)基滅菌時一般不宜采用，以免液體沖出瓶口

ｂ、滅菌鍋內的培養(yǎng)基必須排列疏松，使蒸汽暢通。滅菌鍋內蒸汽是否暢通，關系到滅菌溫度是否均一。滅菌材料若放得過多、過密，會妨礙蒸汽的流通，影響溫度分布的均一，造成局部地區(qū)溫度較低，甚至形成溫度“死角”，達不到徹底滅菌，常常導致以手雜菌污染。

ｃ、滅菌完畢，應緩慢減壓。高壓蒸汽滅菌結束后的排汽降壓不能太快，若排汽太快，瓶內外的壓力差　就會增大，引起瓶塞沖出瓶口；液體培養(yǎng)基滅菌時，液體會突然沸騰，弄臟瓶塞；塑料袋裝培養(yǎng)料滅菌時，應讓其自然冷卻，當壓力下降到0.5Kg/cm2左右時，再打開排氣閥放氣，以免在減壓過程中，袋內外產生壓力差，把塑料袋擊穿，導致以后雜菌污染。

ｄ、注意棉塞防濕。用棉塞塞的瓶子或試管，在高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌時，因鍋中熱蒸汽在鍋壁四周和鍋蓋內側容易產生凝結水，凝結水沿著鍋壁和鍋蓋下流，弄濕棉塞。潮濕的棉塞在培養(yǎng)過程中，容易生長鏈孢霉等霉菌，污染培養(yǎng)物。為了防止棉塞潮濕，滅菌時，瓶子的棉塞不能接觸滅菌鍋壁，瓶子上面就蓋鋁帽或防水油紙，以免鍋蓋下面的水流到棉塞上。滅菌結束時，應先排放鍋內熱水，然后再慢慢排放蒸汽降壓。若棉塞潮濕，可在鍋中烘烤一定時間再取出來。

B.常壓蒸汽滅菌法　采用自然壓力的蒸汽進行滅菌的方法。阿諾氏(Arnold)流通蒸汽滅菌器是微生物技術中常用的設備。我國食用菌菌種生產過程中，有的利用蒸籠滅菌，有的利用鋼筋水泥砌成大型的流通蒸汽滅菌灶，一次可滅菌幾千瓶母種或栽培種培養(yǎng)料。

利用常壓蒸汽滅菌時，滅菌物品在滅菌鍋內排列不能過密，要保證蒸汽能在鍋內均勻地流通。流通蒸汽的溫度一般為100℃左右，要殺死耐熱性的芽胞，

必須延長滅菌時間，一般為6-8小時。這種專用流通蒸汽滅菌灶的最大優(yōu)點是：容量大，

結構簡單，成本低廉，可自行建造。缺點是滅菌時間長，能源消耗量大，稍不注意就有滅菌不徹底的現象發(fā)生。

C.間歇滅菌法　指間歇一定時間，連續(xù)消毒幾次達到滅菌的方法。此方法運用于不耐高溫的(100℃左右)培養(yǎng)基的滅菌。欲殺死培養(yǎng)基的芽胞，

可將其在流通蒸汽中消毒20-30分鐘,先殺死其中的營養(yǎng)體細胞,然后將培養(yǎng)基在室溫或溫箱中培養(yǎng),使芽孢發(fā)芽長成營養(yǎng)體,再用流通蒸汽消毒20-30分鐘,殺死新長成的營養(yǎng)體細胞,這樣連續(xù)3次,即可殺死培養(yǎng)基中的全部芽孢,達到無菌狀態(tài)。

（２）干熱滅菌　采用灼燒或干熱空氣滅菌，稱為干熱滅菌。雖然干燥主熱空氣的穿透力不如濕熱蒸汽強，但它使用方便，適用于玻璃器皿和瓷器等物的滅菌，故廣泛應用于實驗室和生產實踐。干熱滅菌主要有兩種類型。

A.火焰滅菌法

即通過火焰高溫灼燒進行滅菌的方法。耐熱的接種環(huán)、接種鏟、接種匙、接種針等，通過火焰灼燒，可徹底滅菌，試管口和玻璃瓶口，通過幾次火焰，溫度可達200℃以上，一切微生物和芽孢，可全部殺死，達到無菌程度。

B.干熱滅菌法　即利用加熱的高溫空氣進行滅菌的方法。干熱烤箱是干熱滅菌的常用儀器，它是通過電熱絲進行加溫和調溫的，不僅可以用來滅菌，也可用于器皿等材料的烘干。干熱滅菌適用于固體材料滅菌，不適用于液體材料滅菌。由于干熱空氣穿透力　差，加之微生物蛋白質在干燥條件下，不易凝固變質，故干熱滅菌溫度，一般要求掌握在160℃,維持2小時。但要注意，如果干熱滅菌溫度超過170℃,包裝滅菌用品的紙張或棉花布類,會被熱空氣烤焦，甚至有著火燃燒的危險。

２、輻射滅菌　利用輻射產生的能量進行殺菌的方法，稱之輻射滅菌。生產上應用輻射滅菌方法主要是指此外線滅菌。

紫外線滅菌　紫外線是非電離輻射，波長為136-400納米，以波長265-266納米的殺菌為最強。微生物細胞中的核酸堿基對紫外線吸收能力特強，輻射后引起核酸的突變，從而抑制DNA的復制而致死；與此同時，

空氣在的一部分氧在紫外線照射下產生臭氧，也具有很強的殺菌作用。另外，紫外線照射微生物細胞后，在有氧的情況下，產生光化學氧化反應，生成過氧化氫(H2O2),能發(fā)生強烈氧化作用，

引起細胞死亡而達到殺菌目的。由于紫外線穿透物質的能力很差，一層普通玻璃或水，均能濾去大量的紫外線，所以只適用于空氣和物體表面的滅菌，一般要求紫外燈距離照射物不超過1.0米為宜，接種室和接種箱常用紫外燈作為空氣和桌面的消毒。

３、過濾除菌　是利用機械的阻留方法來除去介質中的微生物。在菌種生產上應用的設備主要有超凈工作臺和空氣自凈器，它們均恬于空氣過濾除菌，超凈工作臺主要是使操作臺面達到局部滅菌，而空氣自凈器是使接種室的空氣經過過濾達到整個空間的無菌狀態(tài)。

（二）化學滅菌方法

利用化學藥品滅菌或創(chuàng)造一個無菌環(huán)境，也是非常重要的滅菌手段。許多公演藥品可使菌體蛋白質變性，有的可阻礙微生物的某一代謝環(huán)節(jié)。因此，化學藥品可超到殺菌作用或抑菌作用。直接加入培養(yǎng)基能起滅菌作用，又不影響培養(yǎng)基成分的化學藥品并不多，根據報道β－丙烷內酯(BPL)和焦碳酸二乙酯(PKE)具有這種作用，但應用甚少。有的具有殺菌和抑菌作用，但加入培養(yǎng)基后阻礙了香菇菌絲體生長發(fā)育，也不能被采用。香菇生產中常用的化學藥品及具體使用方法如下。

１、甲醛的殺菌機理是具有強還原作用。甲醛與微生物蛋白質（含蛋白酶）的氨基結合，使蛋白質變性。其反應式為：蛋白－氨基＋甲醛（氣體）→蛋白－氨基、甲醛。甲醛溶液殺菌力比石碳酸強，1:200的甲醛溶液在6-12

小時內可殺死所有的細菌芽孢;并對真菌孢子及營養(yǎng)體均有極強的殺傷力,不受有機物質的影響。因為它具有腐蝕性,刺激性大,不宜人體使用。常用福爾馬林消毒空罐、無菌室或無菌箱等。

使用方法有加熱熏蒸法，即利用福爾馬林沸點96!0的特點，將福爾馬林置于玻璃、陶瓷或金屬容器中，用酒精燈或電爐加熱，藥液蒸發(fā)完，立即撤去熱源。

加高錳酸鉀氧化劑熏蒸法，即甲醛是還原劑，故與氧化劑反應可產生大量熱。這種熱又將蓁甲醛揮發(fā)。具體做法是在坩鍋內（或用培養(yǎng)皿），按每立方米體積加10毫升福爾馬林與1.5克高錳酸鉀的比例計量,任其甲醛揮發(fā),

關好門窗悶一夜或更長時間,能夠達到良好的熏蒸滅菌目的。熏蒸后，室內不斷散發(fā)刺激鼻眼的臭味。

有必要驅除室內甲醛氣味時，可向室內噴灑氨水，氨水濃度為25-28%,

噴的霧滴越小越好,噴氨水的量為熏蒸甲醛的一半,約30分鐘左右,氨水與空氣中殘存甲醛結合,形成白色無臭粉末。如無氨水，可用氯化銨或硫酸銨加石灰水產生氨氣來中和甲醛。銨鹽用量每立方米空間為5-6克。

２、硫磺及其熏蒸滅菌方法　商品硫磺為有光澤的淡黃色粉末（或碎塊），不溶于水，熔點為363℃,燃燒后生成二氧化硫。二氧化硫為無色氣體，有刺激味，滲透力強，易溶于水，生成亞硫酸，有助于提高滅菌率，同時可殺蟲、殺螨。

使用方法是按每立方米空間15-20克計量,將硫磺放置在離地面較高的瓷或金屬容器中，點燃硫磺產生二氧化硫，二氧化硫的密度比空氣大，很容易下沉，所以一定要注意將裝硫磺的容器放在空間較高的位置。為提高滅菌效果，在熏蒸前，應先向空間及墻壁上噴少量水霧，有助于增加二氧化硫與生成亞硫酸，從而提高熏蒸滅菌效果。

硫磺點燃后，對人體呼吸道粘膜、眼結膜有刺激性，應注意防護。二氧化硫對纖維及金屬物品有腐蝕作用，因此，熏蒸房屋時應撤出易腐蝕物品。

除熏蒸與內吸外，其他化學滅菌方法均可歸納為表面滅菌。它們對微生物的毒害作用主要是迅速使細胞表面蛋白質、核酸及有關酶類被破壞。

３、乙醇類　乙醇又稱為酒精。70-80%乙醇的殺菌能力較強。高濃度乙醇殺菌能力反而降低，因為95-100%的乙醇具有很強的脫水作用,當遇到微生物細胞時,

細胞表面很快脫水形成一層保護膜,乙醇分子再不易滲透保護膜起到殺菌作用。

如乙醇中加入稀酸或稀堿，殺菌效力增強。在70%乙醇中加1%硫酸或氫氧化鈉,可在1-2

天內殺死枯草桿菌芽孢。乙醇只會殺死細菌營養(yǎng)體，在香菇生產中，多用于接種時手的皮膚及器械殺菌。使用時，對表面干燥的物品，用70-75%的乙醇擦拭；對于表面略濕潤的物品多采用85%乙醇消毒。乙醇能降低酚、甲醛等殺菌能力，

但能增強硫橫及升汞的殺菌效力。

４、酚及其衍生物　常用的是石碳酸，又名苯酚，純品為無色或白色針狀、塊狀或三棱形晶體，溶于水，具特殊氣味。濃石碳酸能使皮膚變白、手指麻痹并可損壞皮膚與粘膜，對人畜有毒。0.5-1%的石碳酸水溶液作為噴霧劑處理無菌室(箱),

能起到降塵除菌、空氣消毒的作用；也可用3-5%的石碳酸水溶液對器械浸泡消毒。在5%石碳酸水溶液中若加入0.85-0.9%的食鹽則可增加石碳酸藥效,如有乙醇存在時,

則藥效大減。

石碳酸殺菌原理是使細菌蛋白質變性，也具有表面活性劑作用，破壞細胞膜的透性，可合細胞內含物外溢。石碳酸水溶液濃度大時是致死因子；反之，則起抑菌作用。

甲酚是酚的衍生物，又名來蘇爾（煤皂酚），是用肥皂乳化的甲酚，殺菌效力比苯酚大４倍，常用3-5%的溶液消毒皮膚、桌面及用具。

５、石灰與堿類　石灰分為生石灰(CaO)與熟石灰(Ca(OH)2)兩種。起殺菌作用的是熟石灰中的氫氧根離子，能水解蛋白質和核酸，使微生物的酶系和結構受到損害，并能分解菌體中的糖類。

使用生石灰時應加水，或生石灰遇到潮濕的物體，均會生成熟石灰，其化學反應式為：CaO+H2O→Ca(OH)2+熱量。如果熟石灰長時間曝露在空氣中，

可能使熟石灰吸收空氣中的二氧化碳而生成有能殺菌的碳酸鈣，反應式為：Ca(

OH) 2+ CO2→CaCO3+H2O

從反應式中可清楚地看到，如想滅菌只能用生石灰使其與水反應生成熟石灰而殺菌。一般1-3%石灰水就可起很好的殺菌作用。如用0.5%石灰水浸泡稻草２小時或更長時間，也可起到殺菌與軟化纖維的作用。菌筒或菌磚上發(fā)現霉菌污染時，也可將生石灰直接撒到污染菌面上，殺菌效果良好。

６、氧化劑與還原劑　高錳酸鉀、過氧化氫、鹵素（氯、溴、碘）及某些化合物（或絡合物），如漂白粉等均為氧化劑，可以殺菌。亞硫酸及亞硫酸鹽等均為還原劑，能通過氧化還原反應起到殺菌作用。

（１）高錳酸鉀　強氧化劑，1:1000與1:1250的濃度都具有殺菌作用。0.5-1%的高錳酸鉀水溶液于５分鐘內可殺死大多數細菌；５％水溶液于１小時內可殺死細菌芽孢。高錳酸鉀在酸性溶液中殺菌作用增高，如用１％高錳酸鉀和１％鹽酸溶液能在30分鐘內破壞炭疽芽孢。高錳酸鉀遇有機物時被還原成無殺菌作用的二氧化錳。因此，有能用于直接拌料滅菌。高錳酸鉀對霉菌殺傷效果很差。

高錳酸鉀只局限于對皮膚、粘膜及玻璃器皿消毒用，絕不能用于香菇生產原料（木屑等纖維材料）的直接拌料滅菌。

（２）碘及其化合物（絡合物）　3-7%碘溶于70-83%的乙醇中所配制的碘酊,

是皮膚及小傷口的有效消毒劑。5%與10%碘化鉀水溶液也是皮膚有效的消毒劑。

有機碘化物如碘福具有良好殺菌作用，有僅能殺死一般的細菌和真菌，并可使病毒滅活。

（３）漂白粉及其使用方法　漂白粉（氯石灰）是白色粒狀粉末，能溶于水，易生成沉淀。高效漂白粉的有效氯含量為40-80%。漂白粉的使用濃度為５％，通常按每立方米空間用１克高效漂白粉計量。使用時將１克高效漂白粉溶于１升水中，靜放１小時左右，取其上清液噴霧滅菌。

漂白粉的殺菌原理是漂白粉溶于水后，生成次氯酸和次氯酸鹽等，并能釋放氧，使細菌蛋白質或酶發(fā)生氧化；同時，釋放出的氯還能取代蛋白質氨基中的氫離子使蛋白質變性，從而殺滅微生物。

７、重金屬類　一些重金屬及其化合物，可使微生物的蛋白合成受破壞，亦可導致酶失活及取代細胞結構上的主要元素，使微生物生長受掏或導致死亡。

常用的表面消毒劑是二氯化示，又名升汞。1:500-1:2000的升汞溶液對多數細菌有勻菌作用。由于升汞對金屬器皿有腐蝕作用，對人畜有劇毒，目前又合成了對人體低毒的硫柳汞、袂塔酚(metaphen)等。

在香菇生產中常用的硫酸銅也是防治真菌的良好消毒劑，使用濃度低于２％，噴灑物體表面，主要防治青霉類真菌。如將硫酸銅、石灰、水，按1:1:100

的比例所配制成的波爾多深夜，是菇房、床面等的良好表面消毒劑。

８、表面活性劑　具有降低表面張力的物質稱為表面活性劑。常用的肥皂與十二烷基磺酸鈉類（如洗衣粉）的殺菌能力相當于石碳酸的2-3倍。

市售的新潔爾滅是季胺鹽類的表面活性劑?；瘜W名稱為十二烷基溴化胺，淡黃色，有香味的膠狀體。一般可將原液(5%)稀釋一倍，把器械或手、以及不能遇熱的器具進行消毒。對細菌、病毒有較好的殺滅能力，但對真菌殺滅效果不好。經常使用新潔爾滅會使皮膚干裂，同時對粘膜有刺激性，對鋁制品有腐蝕性，對橡膠沒有消毒作用。因此，不能用新潔爾滅消毒膠塞進行擔子菌菌種保藏。

表面活性劑的殺菌機理是改變細胞透性，使菌全破裂；聚集在菌體表面時，影響細胞代謝，破壞細胞蛋白與酶的活性。

９、氣霧消毒盒

三、消毒與滅菌效果的檢查

消毒與滅菌效果好壞，直接關系到菌種成品率的高低。因此，除了要嚴格把好消毒、滅菌關外，同時還要嚴格執(zhí)行檢驗制度，兩者缺一不可。

（一）培養(yǎng)基滅菌效果檢驗

１、試管母種培養(yǎng)基經滅菌后，從高壓滅菌鍋中不同部位隨機抽?。抵?，放置28±2℃恒溫箱中培養(yǎng)5-7天,如無霉菌、細菌、酵母等雜菌出現，則認為滅菌徹底。

２、原種及栽培種培養(yǎng)基經滅菌后，從滅菌鍋中上、中、下三層進行取樣，每層對角線隨機取樣５瓶（袋），放置28-30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-7天，檢查是否有霉菌菌落生成。如檢查是否有細菌沒有殺死，必須使用細菌培養(yǎng)基進行檢測。細菌培養(yǎng)基：稱取牛肉浸膏(或牛肉汁)10克,蛋白胨10克,NaCl15克,瓊脂粉14

克, 加蒸餾水1000ml,經加熱溶解后,裝入試管中,在121℃條件下滅菌15分鐘,隨后排成斜面試管。上述抽取的樣品，分別在無菌下取出少量培養(yǎng)基接入細菌培養(yǎng)基，然后在37℃培養(yǎng)24小時，檢查結果沒有細菌菌落產生，說明滅菌徹底。如某一位置試樣出現雜菌，可能是鍋內有“死角”，也可能是滅菌鍋結構不合理，或沒有按操作要求堆積，　氣撒料，或一次性撒料過厚，或菌種瓶、袋過于擁擠，蒸汽流通不均勻造成；如不分部位，大部分或幾乎全部瓶、袋都出現雜菌，說明滅菌溫度或滅菌時間不夠，如果是高壓滅菌鍋出現這種現象，則說明是冷窯沒有排除干凈所致。

（二）接種室（無菌室）、箱滅菌效果檢驗方法

１、平皿法　先制作常任的霉菌培養(yǎng)基，如CPDA、PDA、BSA等，滅菌后，常規(guī)制作無菌平皿培養(yǎng)基（簡稱平板）。檢查接種室（箱）滅菌合格與否，隨機取幾組無菌平皿培養(yǎng)基（每組3-5個平皿）在接種室（箱）臺面上不同位置打開置放的平皿，

其中一組不打開平皿蓋作為對照，開蓋平皿放置５分鐘，然后蓋上蓋，與對照組同時在30℃培養(yǎng)72小時,檢查在平皿培養(yǎng)基上是否有霉菌菌落。實驗組少于１個菌落，視為滅菌合格。

檢查細菌方法同上，一般采用MPSA培養(yǎng)基。不同的是將實驗的平皿均放置在37℃下培養(yǎng)24小時,至多不超過48小時。

２、試管法　將上述常規(guī)真菌與細菌培養(yǎng)基斜面各取3-5支為一組,放置接種室(箱)內,按無菌操作將其中實驗組棉塞打開,經30分鐘后,再將無菌棉塞塞好,與對照組同時放在30℃和37℃進行(細菌與霉菌)培養(yǎng)。細菌在培養(yǎng)24-28小時后觀察，

霉菌在培養(yǎng)72小時后觀察,實驗組均不長任何菌落,視接種室、箱滅菌良好。