2、單孢分離　就是將采集到的孢子群單個分開進行培養(yǎng)，讓它單獨萌發(fā)成菌絲而獲得純種的方法，單孢子分離的方法，按分離的手段可分為以下三種。

　?。?）稀釋分離法：這是通過不斷稀釋孢子懸浮液，使孢子分散最終孢子濃度控制在300-500個孢子/毫升，吸取0.1毫升的孢子液注入平板均勻涂布，分散孢子各自萌發(fā)形成單孢菌落，其步驟如下：

　　①制備無菌水試管：取10支試管，其中1支裝100毫升蒸餾水，其它9支裝9毫升蒸餾水，經(jīng)高壓滅菌即成無菌水。

　　②制孢子懸液：取一小塊收集有孢子的濾紙條，浸入10毫升無菌水試管中， 搖振使孢子分散成懸液，用無菌1毫升移液管吸取1毫升孢子懸液于第2支試管中， 搖振使其分期，再從第2支試管中吸取1毫升注入第3支試管中， 如此反復稀釋直到孢子濃度達到300-500個孢子/毫升，備用。

　　③制培養(yǎng)基平板：配制PDA培養(yǎng)基，裝入三角瓶中進行高壓滅菌， 準備倒平板的培養(yǎng)皿也經(jīng)過高壓滅菌備用，待已滅菌的PDA冷卻至50-60℃時，在無菌操作下倒15-20 毫升PDA至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放平，晝使培養(yǎng)基表面光滑，厚度一致。

　?、苕咦油坎迹涸跓o菌操作下，吸取0.1毫升的孢子懸浮液滴在平板培養(yǎng)基表面上，使用T氏棒把孢子均勻涂布在平板上，蓋上刺激菌絲培養(yǎng)皿，放置于24-25℃恒溫箱中培養(yǎng)。

　?、萏暨x單孢子萌發(fā)菌落：一般孢子經(jīng)過５天的培養(yǎng)開始萌發(fā)長出菌絲，培養(yǎng)皿經(jīng)過顯微鏡的鏡檢確定孢子萌發(fā)的菌落是由單個孢子萌發(fā)成長而成的，可使用打孔器進行打孔把該菌落移接至新鮮的PDA斜面試管中繼續(xù)培養(yǎng)。 打孔器的外徑應小于顯微鏡的視野范圍，而且打孔之前須檢查該菌落周圍是否有孢子或其它菌落，晝使打孔不會觸及周邊的孢子或菌落，確保純種。

　　（2）毛細管法：孢子懸浮液經(jīng)過稀釋，使用毛細滴管把孢子懸浮液滴一小滴于皿蓋內，晝使每一滴只含有一個孢子，從而達到單孢子分離，其方法如下：

　?、冁咦討腋∫褐苽渫♂尫蛛x法，孢子濃度控制在200-300個孢子/毫升。

　?、诿毜喂苤苽洌喝崈舻牟ＡЧ茉诰凭珖姛羯舷壤赏鈴?毫米的細管， 稍冷卻后再加熱并迅速拉長，使管尖內徑約200微米，剪斷即成毛細滴管，在滴管后端塞棉花， 裝入消毒盒中后進行滅菌備用。

　　③點樣鏡檢：用毛細滴管吸取經(jīng)稀釋的孢子懸浮液約0.1毫升(可滴30滴)，在無菌操作下，快速點于皿蓋內壁的標記圈中央，滴液應小于低倍鏡的視野， 點樣后的培養(yǎng)皿仍蓋在有水瓊脂的皿底上，貼膠布固定后再用低倍銳檢查皿蓋內壁的的液滴，確定是單孢者，即在皿蓋上標上記號。

　　④培養(yǎng)基推貼及刺激培養(yǎng)：使用接種針取一小塊PDA培養(yǎng)基(約2×2毫米方塊) 推貼至標記為單孢子的液滴，使液滴中的孢子能夠吸附到培養(yǎng)基邊緣。 將事先培養(yǎng)好蘑菇氣生菌絲的平板培養(yǎng)皿蓋取下，套在菌絲平板的底部，再把已分離并推貼好的培養(yǎng)基的皿蓋罩在套有菌絲平板的玻璃皿上，使兩個皿蓋對接，貼膠布封口(要留0.5厘米縫用作通氣)，這樣就形成一個刺激單孢子萌發(fā)的培養(yǎng)室，置培養(yǎng)箱中24 ℃下培養(yǎng)，待單孢子萌發(fā)，及時撕下膠布，用接種鏟挑取已萌發(fā)的單孢菌絲貼塊，移接到新鮮PDA斜面試管中，置24℃恒溫箱中培養(yǎng)，即可區(qū)得單孢純種。