靈芝深層發(fā)酵產(chǎn)物中四環(huán)三萜酸定性分析

中草藥 1999年第8期第30卷 藥劑與工藝

作者：李平作*　夏結紅　章克昌

單位：無錫輕工業(yè)大學生物工程學院　214036

關鍵詞：靈芝；四環(huán)三萜酸；紫外光譜；抑菌實驗

　　摘　要　以甲苯-乙酸乙酯-乙酸(12∶4∶0.5)為展開劑，以硫酸-甲醇(1∶1)為顯色劑，通過硅膠薄層層析法由靈芝發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到3種四環(huán)三萜酸，命名為M1、M2和M3，其Rf值分別為0.56，0.49，0.17。并對這3種物質(zhì)的紫外光譜特性進行了研究。抗菌實驗顯示3種四環(huán)三萜酸具有抑制大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、腸炎桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌生長的活性。

　　靈芝中四環(huán)三萜類化合物是近年來發(fā)現(xiàn)的靈芝中另外一類具有明顯藥理活性的化合物。在化學結構上屬于四環(huán)三萜類化合物，具有護肝和排毒［1］、降血壓［2］、降膽固醇［3］等作用。靈芝中四環(huán)三萜首先由Kubota［4］等從靈芝G. lucidum的子實體中得到；此后Nishitoba［5］和Hirotani［6］等作了較多的研究報道；國內(nèi)這方面的研究起步較晚，陳若蕓［7］在他們的綜述中論及靈芝中四環(huán)三萜酸的研究進展；王芳生等［8］報道了赤芝子實體中四環(huán)三萜進行了較深入的研究［9］。筆者報道了靈芝四環(huán)三萜酸的定性分析方法、紫外光譜特征及抑菌活性。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料：試劑均為分析純；硅膠(層析用)300 目，青島海洋化工廠；薄層板5×20 cm，自制；753 W紫外分光光度計。

　　1.2　方法

　　1.2.1　靈芝發(fā)酵產(chǎn)物中四環(huán)三萜酸的提取［6］：發(fā)酵液經(jīng)真空濃縮至原體積的1/5，過濾后，用水飽和正丁醇提取3 次，合并正丁醇提取液，后減壓濃縮至干，殘渣溶于適量的甲醇中，即為粗四環(huán)三萜酸。

　　1.2.2　深層發(fā)酵：25 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)基體積125 L，發(fā)酵溫度30℃，通風量1∶0.75，攪拌轉速180 r/min，接種量1 L，起始pH 5.5，發(fā)酵96 h。

　　1.2.3　抑菌實驗-濾紙透明圈法［10］：①上層培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，酵母膏5，葡萄糖5，NaCl 5，瓊脂18，pH 7.2。下層培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨5，NaCl 5，瓊脂20，pH 7.2。

　　②抑菌效果評價：接種細菌濃度為107 CFU/mL，靈芝酸濃度50 mg/L。抑菌圈直徑5～6 mm為+，7～10 mm為++，抑菌圈不明顯為-。

　　2　結果與討論

　　2.1　靈芝中四環(huán)三萜酸薄層定性分析：利用薄層層析法進行中草藥有效成分的定性分析至今仍是一種常規(guī)的檢測方法。在運用該方法時首先要確定的是采用何種展開劑。我們選擇4種展開劑進行實驗，結果見表1。

　表1　不同展開劑條件下四環(huán)三萜酸的Rf值

系統(tǒng)1 系統(tǒng)2 系統(tǒng)3 系統(tǒng)4 代號

0.26 0.28 0.70 0.56 M1

0.62 0.65 0.67 0.49 M2

0.12 0.15 0.55 0.17 M1

　　系統(tǒng)1-正己烷-乙酸乙酯(1∶1)

　　系統(tǒng)2-正己烷-乙酸乙酯：乙醚(1∶1∶1)

　　系統(tǒng)3-氯仿-乙醚-乙酸乙酯(9∶1∶1)

　　系統(tǒng)4-甲苯-乙酸乙酯-乙酸(12∶4∶0.5)

　　顯色劑：硫酸-甲醇(1∶1)溶液

　　由表1中可以看出，4種展開系統(tǒng)都有3個明顯斑點，它們的Rf值在0.15～0.70之間。由于展開劑的極性不同，使得各物質(zhì)的Rf值不同。以甲苯-乙酸乙酯-乙酸(12∶4∶0.5)為展開劑時，由于加入少量乙酸，使得分離結果非常理想。因此我們選擇系統(tǒng)4為展開劑。

　　顯色劑的選擇：分別以三氯乙酸和硫酸-甲醇為顯色劑進行實驗，前者皆顯黃色，加熱時間長且靈敏度不高。以硫酸-甲醇(1∶1)為顯色劑時，加熱時間短，顯色速度快，120℃加熱15～20 min即顯色。而且以硫酸-甲醇為顯色劑時，還可以判別三萜酸基本結構的飽和與不飽和情況［10］。在實驗中我們觀察到M1(Rf=0.56)和M2(Rf=0.49)先顯亮紅色，然后變?yōu)樽仙籑3(Rf=0.17)則由橙色變?yōu)樽仙?，這表明三種靈芝中四環(huán)三萜酸都具有不飽和特性，否則呈黃色并逐漸褪色。因此我們選擇硫酸-甲醇=1∶1為顯色劑，圖1是以系統(tǒng)4為展開劑時靈芝中四環(huán)三萜酸的薄層層析圖譜。

圖1　靈芝四環(huán)三萜酸的薄層層析圖譜

　　2.2　靈芝中四環(huán)三萜酸的紫外光譜特征：由于靈芝中四環(huán)三萜酸中含有共軛體系，因而通常在紫外區(qū)有吸收峰。將分離的3種四環(huán)三萜酸在紫外區(qū)進行吸收掃描，得到如下的譜圖(圖2)。

　　從圖2中可以看出，3種四環(huán)三萜酸在220～260 nm中都有不同程度的吸收峰，已有的文獻報道［7］也證明靈芝中四環(huán)三萜酸在此范圍內(nèi)有明顯的吸收。由圖2可以看出M1的最大紫外吸收峰在254 nm左右；M2的最大吸收峰在243 nm左右；M3的最大吸收峰在224 nm左右。

圖2　M1、M2、M3紫外光譜圖

　　2.3　靈芝中四環(huán)三萜酸的抗菌活性：通過濾紙透明圈法檢測了靈芝酸對不同微生物的抑菌活性。結果見表2。

　　表2　靈芝酸的抑菌作用

　 腸炎桿菌 產(chǎn)氣桿菌 金黃色

　　葡萄球菌

大腸桿菌 枯草桿菌

M1 ++ ++ ++ ++ +

M2 + ++ + ++ -

M3 ++ + + ++ -

　　3　小結

　　3.1　確定了靈芝中四環(huán)三萜酸的硅膠薄層定性分析法，適宜的展開劑組成是甲苯-乙酸乙酯-乙酸＝12∶4∶0.5；顯色劑組成是硫酸-甲醇=1∶1，而且利用該顯色劑可以初步判斷靈芝中四環(huán)三萜酸母核上的不飽和性。分離得到的3種靈芝三萜酸的Rf值分別為0.56，0.49，0.17。

　　3.2　紫外吸收光譜表明，M1的最大吸收在254 nm，與有關的報道基本相一致。在C11位不存在羰基的化合物，大都有△7［8］△9［11］雙鍵，其紫外吸收大多在237 nm，244 nm，253 nm，M2的紫外光譜特征在此范圍內(nèi)。而在既沒有α、β不飽和酮，又沒有共軛雙鍵的化合物中，紫外吸收在λmax210 nm左右，M3有可能屬于此范圍。

　　3.3　抗菌實驗顯示3種四環(huán)三萜酸具有抑制大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、腸炎桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌生長的活性。

　　參考文獻

　　1　Hirotani M, et al. Chem Pharm Bull, 1986, 34:2282

　　2　Morigiwa A, et al. Chem Pharm Bull, 1986, 34:3025

　　3　Shiao M-S, et al. J Nat Prod, 1987, 50:886

　　4　Kubota T, et al. Helv Chim Acta, 1982， 62:611

　　5　Nishitoba T, et al. Agr Biol Chem, 1984, 48:2905

　　6　Hirotani M, et al. Chem Pharm Bull， 1986, 34:2282

　　7　陳若蕓，等.藥學學報，1990，25(12)：940

　　8　王芳生，等.藥學學報，1997，32(6)：447

　　9　李平作.無錫輕工大學博士論文，1997.12

　　10　錢存柔，等編.微生物學實驗.北京：北京大學出版社，1985：196

　　11　Wall M E, et al. J Biol Chem， 1952, 198：533