航天誘變育種對金針菇遺傳和藥用品質性狀的影響

林藝美,賴亮民,鐘武杰,黃舒婷,王家佩,王杰* 

(華南農業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642)

收稿日期:2023-05-05

基金項目:廣東省重點領域研發(fā)計劃資助項目(2018B020206001); 廣東省鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略專項資金(20210722); 廣東省農業(yè)廳種業(yè)振興項目(2022-WPY-00-004)

*通信作者:王杰,教授,博導,主要從事食藥用菌生物工程研究,E-mail:wjcasey@scau.edu.cn。

[目的]本文旨在利用航天誘變技術，選育獲得金針菇特色優(yōu)質種質資源。[方法]對金針菇菌株F3-1進行航天誘變處理，通過拮抗試驗、分子標記試驗和活性物質測定等對航天誘變菌株進行篩選鑒定及遺傳變異多樣性分析，并篩選活性物質含量高的菌株。[結果]拮抗試驗初篩獲得7株與出發(fā)菌株存在拮抗現(xiàn)象的變異株。分子標記(ISSR、RAPD、SRAP)聚類分析結果表明，7個誘變菌株與出發(fā)菌株的遺傳相似系數(shù)為0.694～0.962，且在遺傳相似系數(shù)為0.800時可分為3個類群。誘變菌株與出發(fā)菌株的菌絲生長速度、生物量、總酚、類黃酮、多糖和麥角硫因等指標的變異系數(shù)為7.68%～38.97%，遺傳多樣性指數(shù)H'為1.53～2.00。其中，多糖含量的變異系數(shù)最高，受誘變影響大; 總酚的遺傳多樣性指數(shù)最大，誘變類型豐富。生物學特性聚類分析顯示，在遺傳距離為3.16時分為3個類群。最終篩選獲得2株活性物質含量高的菌株(T2和T5)，其中T2菌株生長速度、生物量和活性物質等均優(yōu)于出發(fā)菌株，而T5菌株主要表現(xiàn)為高多糖含量菌株，其多糖含量比出發(fā)菌株提高114.70%(P<0.01)。[結論]航天誘變處理的金針菇菌株存在豐富的遺傳變異多樣性，是新品種選育的優(yōu)異種質資源。

關鍵詞：金針菇; 航天育種; 分子標記; 藥用品質性狀; 遺傳多樣性

Effects of spaceflight mutagenesis breeding on genetic and medicinal quality traits of Flammulina filiformis

LIN Yimei,LAI Liangmin,ZHONG Wujie,HUANG Shuting,WANG Jiapei,WANG Jie* 

(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

[Objectives]This article aimed to obtain characteristics and high-quality germplasm resources of Flammulina filiformis by space mutagenesis technology. [Methods]F.filiformis strain F3-1 was subjected to aerospace mutagenesis. Spaceflight mutagenesis strains were screened, characterized and analyzed for diversity of genetic variations by experiments such as antagonistic experiments, molecular marker experiments and determination of active substances. Strains with high contents of active substances were screened. [Results]Seven variants with obvious antagonism to the starting strain were obtained by antagonism test. Molecular marker(ISSR, RAPD, SRAP)clustering analysis showed that the seven mutant strains and starting strain shared genetic similarity coefficients from 0.694 to 0.962, and could be classified into three clusters at a genetic similarity coefficient of 0.800. The variation coefficients such as mycelial growth rate, biomass, phenolics, flavanoid, polysaccharide and ergothionein between mutagenized and starting strains ranged from 7.68% to 38.97%, and the genetic diversity index H' ranged from 1.53 to 2.00. Among them, the highest coefficient of variation was found for polysaccharide content, indicating that it was greatly affected by mutagenesis; the genetic diversity index was largest for total phenols, indicating its rich mutagenesis types. Biological properties cluster analysis revealed three clusters at a genetic distance of 3.16. Finally, two high polysaccharide content strains(T2 and T5)were obtained by screening, among which T2 was superior to the starting strain in terms of growth rate, biomass and active substances, while T5 was mainly characterized as a high polysaccharide content strain with 114.70% higher polysaccharide content than the starting strain(P<0.01). [Conclusions]There was abundant genetic variation diversity in the strains treated by spaceflight mutagenesis, which was an excellent germplasm resource for new variety breeding.

Keywords：Flammulina filiformis; spaceflight breeding; molecular marker; medicinal quality traits; genetic diversity

引言

金針菇(Flammulina filiformis),別名冬菇、樸菇等,其菌蓋滑嫩、菌柄細長脆嫩,形美,味鮮,具有較高的營養(yǎng)價值[1]; 其富含活性物質如多糖、總酚、類黃酮、麥角硫因等,已被證實具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血糖、降血脂等藥用作用[2-7],具有一定的藥用價值。金針菇是目前最廣泛食用的菌類之一,也是我國食用菌生產的常規(guī)主品種之一,2020年年產量達227.91萬t[8]。然而,我國現(xiàn)有的金針菇種質資源匱乏,工廠化生產所用的菌種主要依賴國外品種,缺乏自主知識產權的優(yōu)良品種[9]。目前,有些國家的金針菇品種已細化為食用菌種和藥用菌種,其育種方向也不斷向菌物藥方向延伸[10]; 我國對于高營養(yǎng)和藥用價值的金針菇新品種的育種研究較少,限制了其深加工行業(yè)的發(fā)展。隨著金針菇市場需求的快速增長,金針菇產業(yè)對優(yōu)良種源的需求更加迫切。

航天育種的原理為通過航天搭載,利用太空環(huán)境的特殊誘變作用(太空微重力和輻射等復合作用)使菌種發(fā)生遺傳變異,再通過地面選育可獲得新品種[11-12]。航天育種具有誘變頻率高、變異類型豐富,育種周期短,能快速打破基因連鎖、促進優(yōu)異基因聚合等特點,能創(chuàng)造傳統(tǒng)雜交育種無法短期得到的新的優(yōu)良品種,是一種高效的育種技術[13-15]。目前,金針菇的航天誘變育種研究主要集中在耐高溫和早熟性特性上[16],尚未關注分子水平和生物學特性的遺傳多樣性; 且金針菇的育種方向主要集中于高產、抗病、廣溫等優(yōu)良菌株的篩選[17],缺少對高活性物質含量菌株的選育研究。

本研究擬對金針菇菌絲體進行航天誘變處理,以拮抗反應為指標初步篩選變異株,利用ISSR、RAPD、SRAP等分子標記進行菌株之間的遺傳變異分析。通過測定出發(fā)菌株與誘變菌株的生長速度、生物量、活性物質含量等,分析其藥用品質性狀的遺傳多樣性,以期揭示航天誘變處理對金針菇菌株藥用品質性狀的影響,同時對高活性物質含量菌株進行篩選。研究結果可為優(yōu)質特色金針菇新品種的選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇菌株F3-1,購于廣東省微生物研究所菌種保藏中心。ISSR引物、RAPD引物和SRAP引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。San Taq Plus PCR Mix試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司。PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,蔗糖20 g,瓊脂粉20 g,水1 L,pH自然,121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

Avanti J-E超高速冷凍離心機購于BECKMAN COULTER公司; Fastwin BIS-168凝膠成像系統(tǒng)購于Fastwin Bio-tech公司; T-1 Biometra熱密閉PCR儀購于德國Biometra公司; Waters高效液相色譜儀購于沃特世科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株航天誘變處理

取試管母種接入PDA培養(yǎng)基,25 ℃培養(yǎng),連續(xù)活化培養(yǎng)3代。取活化后的金針菇菌塊于無菌條件下裝入凍存管,搭載長征五號B運載火箭進入太空進行航天誘變處理。

1.3.2 航天誘變菌株活化

刮取凍存管中金針菇菌塊上的菌絲于10 mL無菌水中,加入玻璃珠混勻打碎,稀釋10倍,并采用傾注法接至PDA培養(yǎng)基,25 ℃培養(yǎng)。挑取46個航天誘變處理組金針菇單菌落,連續(xù)培養(yǎng)3代使性狀穩(wěn)定,進行后續(xù)篩選和分析。

1.3.3 拮抗試驗篩選

使用打孔器取大小一致的航天誘變處理組金針菇菌塊和出發(fā)菌株CK組金針菇菌塊接至同一平板,菌塊相距2 cm,25 ℃下對峙培養(yǎng),觀察是否出現(xiàn)拮抗現(xiàn)象,初步篩選變異株。

1.3.4 分子標記鑒定

參照王艷[18]的DNA提取方法提取金針菇菌株基因組DNA。采用San Taq Plus PCR Mix試劑盒,以金針菇基因組DNA為模板,以4個ISSR引物、3個RAPD引物和5個SRAP引物進行PCR擴增,PCR產物經10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳,并使用凝膠成像系統(tǒng)進行觀察記錄,用于分子標記的遺傳多樣性分析。

ISSR引物序列(I2、I12、I13、I18)、RAPD引物序列(JS6、JS9、JS15)、SRAP引物序列(Me2-Em8、Me2-Em2、Me3-Em72、Me4-Em2、Me5-Em72)見表1。ISSR和RAPD擴增反應程序:94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 1～2 min,循環(huán)35次; 72 ℃延伸10 min。SRAP擴增反應程序:94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,35 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,5個循環(huán); 然后94 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,循環(huán)30次; 72 ℃延伸10 min。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequence

1.3.5 藥用品質性狀測定

使用打孔器打取相同數(shù)量的直徑8 mm的金針菇出發(fā)菌株及誘變菌株菌塊,接入100 mL PDB培養(yǎng)基,25 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d,用于生物量、總酚、類黃酮、多糖、和麥角硫因等指標的測定。采用十字交叉法測定菌絲生長速度,將通過拮抗試驗篩選的菌株打孔接至PDA培養(yǎng)基,25 ℃培養(yǎng),菌絲萌發(fā)后在菌絲邊緣標記起始點位,培養(yǎng)完成后標記終止點位,菌絲生長速度用菌落直徑的增長值與時間的比值表示。使用抽濾裝置將振蕩培養(yǎng)7 d的金針菇菌絲過濾,將過濾后的菌絲球用蒸餾水沖洗數(shù)次,置于60 ℃烘箱烘干至恒重,稱重并記錄,計算菌絲生物量。

采用Folin-Ciocalteu法測定胞內總酚含量。取金針菇菌絲,加入80%乙醇充分研磨,70 ℃水浴浸提,選用沒食子酸為總酚測定標準品進行測定。采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法測定胞內類黃酮含量。提取方法同測定總酚含量的方法,選用蘆丁標準液為類黃酮測定標準品,類黃酮的量表示為每克提取物的蘆丁毫克當量。采用苯酚-硫酸法測定胞內多糖含量。取金針菇菌絲,加入95%乙醇進行超聲(1 000 Hz)提取加熱回流2 h,趁熱過濾,即得多糖提取液,選用葡萄糖為多糖測定標準品進行測定。采用莫宇麗等[19]的方法提取并測定胞內麥角硫因含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)ISSR、RAPD、SRAP的電泳結果,多態(tài)性條帶被記為“1”,非多態(tài)性條帶被記為“0”,以此產生“0-1”矩陣,使用NTSYS軟件系統(tǒng),采用UPGMA進行聚類分析,以Dice系數(shù)生成ISSR、RAPD、SRAP的遺傳相似性矩陣和綜合聚類圖。

對生長速度、生物量、總酚含量、類黃酮含量、多糖含量及麥角硫因含量等進行差異分析、變異分析與遺傳多樣性分析、聚類分析。變異系數(shù)=(標準偏差/平均值)×100%。將藥用品質性狀結果進行4個等級的劃分:1級≤x-0.5σ,4級>x+0.5σ,每0.5σ為1級,σ為標準差,x為平均值。根據(jù)藥用品質性狀結果的分級賦值,使用Excel 2016軟件根據(jù)公式計算出其遺傳多樣性指數(shù)。遺傳多樣性指數(shù)計算采用Shannon-Weaver信息指數(shù)(H'),H'=-∑Piln Pi(i=1,2,…,n),其中Pi指某藥用品質性狀第i個級別占總數(shù)的比例。將藥用品質性狀數(shù)據(jù)作標準化轉換,采用UPGMA進行聚類分析,以歐氏距離生成藥用品質性狀的遺傳距離矩陣和綜合聚類圖。

2 結果與分析

2.1 誘變菌株的體細胞親和性試驗

通過拮抗試驗篩選得到7個與出發(fā)菌株具有拮抗反應的航天誘變菌株,結果如圖1所示。T1、T4、T6和T7菌株與出發(fā)菌株CK有拮抗現(xiàn)象,但無明顯拮抗線,即菌株間有弱拮抗; T2、T3和T5菌株與出發(fā)菌株CK之間有氣生菌絲隆起的現(xiàn)象,菌株間拮抗作用明顯?？沙醪脚袛?個金針菇航天誘變菌株與出發(fā)菌株存在不同程度的體細胞不親和性。

圖1 拮抗試驗

Fig.1 Antagonistic experiment

2.2 誘變菌株的分子標記鑒定分析

2.2.1 ISSR、RAPD、SRAP多態(tài)性分析

ISSR、RAPD和SRAP分子標記試驗顯示,7個航天誘變菌株與出發(fā)菌株間存在多個變異位點。通過ISSR-PCR電泳圖譜(圖2)篩選出3條多態(tài)性較高、譜帶清晰、重復性好的ISSR引物(I12、I13、I18),擴增的總譜帶數(shù)為12條,其中7條具有多態(tài)性,多態(tài)性比率為58.33%。RAPD-PCR電泳圖譜(圖3)顯示3個RAPD引物(JS6、JS9、JS15)均能擴增出清晰的譜帶,表現(xiàn)出良好的多態(tài)性,可用于驗證試驗,擴增的總譜帶數(shù)為10條,均具有多態(tài)性,多態(tài)性比率為100%。對5個SRAP引物進行篩選,試驗獲得共計3個SRAP引物(Me2-Em8、Me3-Em72、Me5-Em72)可用于驗證試驗,3個引物可獲得清晰可辨的位點及多態(tài)性位點,擴增的總譜帶數(shù)為16條,其中8條具有多態(tài)性,多態(tài)性比率為50%,擴增產物電泳圖如圖4所示。

圖2 ISSR-PCR電泳圖譜

Fig.2 Electropherogram of ISSR-PCR

圖3 RAPD-PCR電泳圖譜

Fig.3 Electropherogram of RAPD-PCR

圖4 SRAP-PCR電泳圖譜

Fig.4 Electropherogram of SRAP-PCR

2.2.2 ISSR、RAPD、SRAP的遺傳相似性矩陣和綜合聚類分析

由表2和圖5可以看出,每個菌株之間的遺傳距離都不為0,且擁有直系同源基因; 8個菌株遺傳相似系數(shù)為0.694～0.962,說明彼此有一定的遺傳差異,不屬于同一株,表明7個誘變菌株發(fā)生了不同程度的變異。同時,綜合聚類分析圖(圖5)顯示,在遺傳相似系數(shù)為0.800時,8個菌株被分為3個類群:出發(fā)菌株CK、T1聚為第Ⅰ類,T6、T7聚為第Ⅱ類,T2、T3、T4、T5聚為第Ⅲ類; 第Ⅲ類在相似系數(shù)為0.880時分為2個亞類,T2、T3、T5聚為第1個亞類,T4為第2個亞類。其中,遺傳相似性矩陣(表2)顯示,T3和T5的遺傳相似系數(shù)最高,達0.962,有著緊密的親緣關系; 而T4和T7的遺傳相似系數(shù)最低,為0.694,即T4和T7間的親緣關系最遠。

表2 ISSR、RAPD和SRAP遺傳相似性矩陣

Table 2 Genetic similarity matrix of ISSR,RAPD and SRAP

圖5 ISSR、RAPD和SRAP綜合聚類

Fig.5 Dendrogram of ISSR,RAPD and SRAP

2.3 藥用品質性狀變化分析

2.3.1 菌絲生長速度與產活性物質能力的差異性分析

由表3可知,金針菇航天誘變菌株菌絲與出發(fā)菌株菌絲間的生長速度與產活性物質能力差異明顯。T2菌株的菌絲生長速度極顯著高于其他菌株,比出發(fā)菌株提高30.99%; 除T4外,其余6株航天誘變菌株的生物量均極顯著高于出發(fā)菌株,T6生物量最高,比出發(fā)菌株提高21.46%; 7株航天誘變菌株的總酚含量與出發(fā)菌株沒有極顯著的差異; T2、T3、T4、T5和T7菌株的類黃酮含量均極顯著高于出發(fā)菌株,其中T3的類黃酮含量比出發(fā)菌株提高97.80%; T2和T5菌株的多糖含量均極顯著高于出發(fā)菌株,T5的多糖含量最高,比出發(fā)菌株提高114.70%; T2菌株麥角硫因含量極顯著高于出發(fā)菌株,比出發(fā)菌株提高11.96%。

表3 菌絲生長速度與產活性物質能力差異性分析

Table 3 Analysis of differences in mycelial growth rate and ability to produce active substances

2.3.2 產活性物質能力的變異分析與H'分析

金針菇航天誘變菌株菌絲與出發(fā)菌株菌絲間的產活性物質能力的變異分析與H'分析見表4。結果顯示,誘變菌株和出發(fā)菌株的菌絲變異較大,變異系數(shù)的變幅為7.68%～38.97%,變異系數(shù)差異明顯,其變異系數(shù)由小到大依次為多糖、類黃酮、麥角硫因、生物量、總酚。變異系數(shù)大于20%的有多糖、類黃酮,表明其受航天誘變影響較大,以多糖變異系數(shù)最高,誘變影響最突出; 生物量和總酚的變異系數(shù)小于10%,說明其受誘變影響不明顯,變異較小。遺傳多樣性指數(shù)H'為1.53～2.00,總酚的遺傳多樣性指數(shù)最高,即總酚的變異類型更豐富。

表4 產活性物質能力的變異分析與遺傳多樣性指數(shù)H'分析

Table 4 Analysis of variation and genetic diversity index H' of the ability to produce active substances

2.3.3 突變菌株性狀遺傳距離矩陣和綜合聚類分析

各菌株生物學特性的遺傳距離見表5,遺傳距離變幅為1.418 6～4.751 2。7株誘變菌株與CK的遺傳距離均不為0,說明其與出發(fā)菌株存在表型差異。通過聚類分析,在遺傳距離為3.16處將出發(fā)菌株和誘變菌株聚為3個類群,見圖6。第Ⅰ類群包括T2和T5,該類群中的菌株均含有高含量的總酚、類黃酮、多糖和麥角硫因; 第Ⅱ類群包括T3和T4,該類群中的菌株含有高含量的類黃酮,但麥角硫因的含量較低; 第Ⅲ類群包括CK、T1、T6和T7,其生長速度、類黃酮含量和多糖含量較低。

表5 突變菌株性狀遺傳距離矩陣

Table 5 Genetic distance matrix of mutant strain traits

圖6 突變菌株性狀的綜合聚類

Fig.6 Dendrogram of mutant strain traits

3 討論

航天誘變會對生物材料的組織、細胞結構、生理代謝途徑及遺傳物質產生影響。本研究利用該特點對金針菇菌絲進行航天誘變處理,以期獲得優(yōu)質特色金針菇新品種。

拮抗反應目前作為一種鑒定菌株遺傳差異的傳統(tǒng)方法廣泛用于絲狀真菌種內菌株的鑒定和分類。本研究通過拮抗試驗發(fā)現(xiàn)7個航天菌株與出發(fā)菌株出現(xiàn)強弱不定的拮抗現(xiàn)象,說明7個航天菌株與出發(fā)菌株存在不同程度的不親和性。

ISSR、RAPD、SRAP等分子標記可從DNA水平反映菌株間的遺傳差異,常用于進行菌株間親緣關系及遺傳多樣性研究。何法慧等[20]應用SSR和SRAP等技術揭示狗牙根不同種質材料間存在遺傳差異; 趙麗麗等[21]利用ISSR標記揭示輻射誘變白刺花可導致后代中產生豐富的遺傳多樣性; 李艷麗等[22]通過RAPD標記發(fā)現(xiàn)紫外線誘變刺芹側耳菌株與親株有顯著的遺傳差異,暗示其為一株新的刺芹側耳變異菌株。本研究基于ISSR、RAPD、SRAP引物擴增出的圖譜結果進行遺傳多樣性和聚類分析,結果顯示7個航天誘變菌株和出發(fā)菌株的遺傳相似系數(shù)為0.694～0.962,誘變菌株和出發(fā)菌株被聚為3類,表明誘變菌株與出發(fā)菌株間具有親緣關系,但存在遺傳差異,判斷誘變菌株為新的金針菇變異菌株,且誘變菌株在分子水平上具有豐富的遺傳多樣性。

遺傳物質的變化往往會影響生物體的性狀變化。本研究發(fā)現(xiàn)本次航天誘變金針菇菌絲對其藥用品質性狀產生明顯影響。研究發(fā)現(xiàn),多糖和類黃酮的變異系數(shù)較高,總酚的H'值最高。在選育新品種的過程中,變異系數(shù)和H'值越大,表明遺傳多樣性越豐富。因此,本次金針菇的航天誘變菌株的活性物質存在豐富的遺傳多樣性,有利于豐富金針菇的種質資源。遺傳聚類發(fā)現(xiàn)T2、T5菌株與其他菌株的遺傳距離較遠,且其活性物質含量較高。與出發(fā)菌株相比,T2菌株的生長速度、生物量、類黃酮含量、多糖含量、麥角硫因含量分別提高30.99%、10.32%、37.17%、60.74%、11.96%,是金針菇高活性成分生產菌種的潛力菌株。而T5菌株多糖含量高,比出發(fā)菌株提高114.70%。航天誘變對決明[23]、夏枯草[24]、柴胡[25]等活性物質具有顯著影響,且大多存在正向影響。本研究利用航天誘變獲得2株具有高活性物質的金針菇菌株,可為金針菇深加工產業(yè)提供優(yōu)質的種質資源,為優(yōu)質特色金針菇新品種的選育提供參考依據(jù)。

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來源：《南京農業(yè)大學學報》 作者:林藝美, 賴亮民, 鐘武杰, 黃舒婷, 王家佩, 王杰